Virus di bawah mikroskop: dari pengimejan ke manipulasi

Virus di bawah mikroskop: dari pengimejan ke manipulasi

Denis Korneev
"Tangan Pertama Sains" № 3/4 (57/58), 2014

Virus adalah objek yang sangat kecil, berukuran dari beberapa puluhan hingga beberapa ratus nanometer. Yang pertama dan selama beberapa dekad satu-satunya kaedah visualisasi mereka adalah mikroskop elektron, yang memungkinkan bukan sahaja untuk mempelajari secara terperinci struktur zarah virus itu sendiri, yang disebut virion, tetapi juga untuk menyiasat proses yang berlaku dalam sel yang dijangkiti – replikasi virus. "Monopoli" mikroskop elektron telah dipecahkan oleh penampilan pada awal tahun 1980-an kelas asas peranti baru – mengimbas mikroskop probe.

Mikroskop berkuasa atom yang dimiliki oleh kelas ini ternyata menjadi alat yang sesuai untuk mengkaji objek biologi dan dibenarkan bukan sahaja untuk menggambarkan struktur nano, tetapi juga untuk memanipulasi mereka. Khususnya, manipulasi virion tunggal dan pengukuran langsung kuasa-kuasa yang timbul daripada hubungan mereka dengan permukaan sel ternyata pada asasnya mungkin. Percubaan-percubaan sedemikian membolehkan untuk mendapatkan data terperinci tentang yang pertama dan dalam kebanyakan kes masih belum cukup tahap kajian jangkitan sel – lekatan virus ke permukaannya.Kajian-kajian ini mempunyai kepentingan praktikal yang besar, sejak boleh memberikan kunci untuk mewujudkan ubat antivirus yang berkesan yang melindungi sel daripada penembusan virus.

Mengenai pengarang

Denis Vladimirovich Korneev – Penyelidik, Makmal Penyelidikan Ultrastructural, Pengerusi Majlis Ilmuwan Muda Pusat Saintifik Negeri Virologi dan Bioteknologi "Vektor" (rantau Novosibirsk, Koltsovo). Pengarang dan penulis bersama 11 kertas saintifik.

Dalam lagu terkenal Vladimir Vysotsky, ia dinyanyikan: "… anda tidak akan menangkap neutrino oleh janggut / Dan anda tidak akan meletakkannya dalam tiub ujian …". Sudah tentu, virus bukan neutrino, bukan atom, atau bahkan molekul, tetapi masih objek yang sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat bukan hanya dengan mata tetapi juga dalam mikroskop cahaya konvensional. Walau bagaimanapun, mikroskop elektron, yang meningkatkan keupayaan penglihatan kami beratus-ratus kali, menjadikannya bukan sahaja untuk melihat objek yang menakjubkan ini, tetapi juga untuk memeriksa mereka dengan terperinci yang paling kecil. Dan mikroskopi tenaga atom, yang sama-sama mengasah rasa sentuhan kami, membenarkan kami melakukan manipulasi mekanikal secara langsung terhadap zarah virus.

Virus adalah objek yang sangat kecil – saiz mereka dari beberapa puluhan hingga beberapa ratus nanometer. Yang pertama dan untuk masa yang lama satu-satunya kaedah visualisasi langsung zarah nano adalah mikroskop elektron (EM), yang mula berkembang pada tahun 1930-an. Kaedah ini, yang ternyata sangat bermaklumat, memungkinkan bukan sahaja untuk menerangkan secara terperinci struktur pelbagai virus, tetapi juga untuk menyiasat proses yang berlaku dalam sel yang dijangkiti.

Ternyata bentuk zarah virus adalah sangat berbeza: dari sfera biasa hingga struktur kompleks menyerupai bata, terpaku dengan tubulus (virus variola), atau cacing bristly (virus virus Ebola).

Lebih banyak kepelbagaian telah dijumpai untuk strategi replikasi (pembiakan) virus. Satu-satunya harta asas yang biasa untuk semua virus tanpa pengecualian ialah status parasit intraselular mereka. Ini bermakna agar virus itu berkembang biak, bahan genetiknya mesti menembusi sel hidup dan "menangkap" radas enzimatiknya, menukar virus itu untuk membuat salinan virus.

Di luar sel, mana-mana virus hanya merupakan bekas molekul dengan bahan genetik (DNA atau RNA) dan tidak dapat dianggap sebagai organisma hidup yang sepenuhnya, walaupun masih belum ada kepastian terminologi definitif mengenai isu ini dalam komuniti saintifik.

Kekhususan mikroskop elektron adalah kajian tetap, iaitu objek yang disediakan dengan cara yang istimewa – sebenarnya, ia hanya berfungsi dengan perkara "mati"*. Setelah hanya "momen beku", penyelidik hanya dapat membina hipotesis tentang dinamika proses yang dikaji, kerana dia tidak dapat melihat aliran mereka dalam waktu nyata.

Oleh itu, kajian replikasi virus oleh mikroskopi elektron penghantaran pada bahagian ultrathin adalah seperti berikut: sel yang dijangkiti dirawat dengan penyelesaian penetapan, dehidrasi dengan alkohol dan dituangkan dengan resin khas. Selepas resin telah mengeras dengan menggunakan peranti khas – seksyen ultratom – ultrathin (≈ 50 nm) dibuat, yang kemudiannya digunakan untuk mesh khusus dan dirawat dengan penyelesaian garam logam berat. Semasa peperiksaan mikroskopik itu sendiri, sampel itu berada dalam ruang vakum dan terdedah kepada rasuk elektron.dengan tenaga beberapa puluh keV. Jelas sekali, pengimejan intravital dalam kes ini adalah mustahil pada dasarnya.

Selama hampir setengah abad, mikroskop elektron kekal satu-satunya kaedah untuk membayangkan objek nano. Walau bagaimanapun, pada awal 1980-an. monopoli ini telah pecah oleh kedatangannya pengimbasan mikroskopi siasatan (SPM). Prinsip utama SPM adalah imbasan – ketepatan (dengan ketepatan yang tinggi) pergerakan siasatan berhampiran permukaan di bawah kajian, ditambah dengan mengesan parameter spesifik yang menggambarkan interaksi antara siasatan dan sampel. Hasil imbasan ini adalah peta topografi permukaan sampel.

SPM peranti pertama menjadi mengimbas mikroskop terowong (STM), yang hanya boleh digunakan dengan sangat terhad untuk visualisasi objek biologi, kerana kerja-kerjanya memerlukan kekonduksian elektrik yang tinggi di permukaan di bawah kajian.

Pada tahun 1986, ahli fizik Swiss, G. Binnig dan rakan-rakannya mencipta peranti baharu keluarga SPM – mikroskop berkuatkuasa atom (AFM). Asas karyanya adalah kekuatan (Van der Waals) interaksi atom probe dan permukaan.AFM tidak memerlukan kekonduksian elektrik permukaan sampel, dan ia boleh menjalankan kaji selidik dalam medium cecair. Oleh itu, peranti ini ternyata menjadi alat yang mudah untuk mengkaji objek biologi.

Rajah skematik mikroskop berkuatkuasa atom (AFM). Unsur sensitif AFM adalah konsol elastik (cantilever), pada akhir yang mana satu penyelidikan akut diperbaiki. Kuasa-kuasa yang timbul di antara atom-atom di hujung siasatan dan permukaan di bawah kajian membawa kepada ubah bentuk cantilever, yang pada gilirannya ditetapkan dengan cara sistem optik yang dilaksanakan di kebanyakan AFM moden berdasarkan laser semikonduktor dan photodetector empat bahagian. Saiz cantilever adalah 100 ÷ 300 × 20 ÷ 40 mikron dengan ketebalan kira-kira 2 mikron. Ketinggian probe – kira-kira 10 mikron

Sejak penampilan mikroskop berkuatkuasa atom, sejumlah besar kertas telah diterbitkan pada pencitraan AFM pelbagai jenis sampel biologi. Walau bagaimanapun, perlu diiktiraf bahawa dalam kebanyakan kes, dari segi pengimejan, AFM tidak menyediakan apa-apa asas baru berbanding dengan mikroskop elektron konvensional, dengan itu, kaedah ini sering dilihat oleh ahli biologi sebagai eksotik teknikal, dan bukan sebagai alat penyelidikan yang lengkap.

Walau bagaimanapun, yang paling penting, walaupun hampir satu-satunya kelebihan visualisasi objek biologi menggunakan AFM berbanding dengan mikroskop elektron adalah keupayaan untuk melakukan penyelidikan pada sampel asli, asli tanpa sebarang penetapan dan penyediaan sampel khas, dengan parameter fisiologi persekitaran.

Di samping memvisualisasikan pelepasan permukaan dengan resolusi subnanometer, AFM membenarkan pengukuran langsung dari daya yang timbul daripada interaksi objek nano tunggal.

Pengukuran sedemikian dilakukan seperti berikut: satu objek ditetapkan pada ujung probe AFM, dan yang kedua adalah tetap pada substrat, selepas itu siasatan dibawa ke permukaan substrat sehingga kontak mekanikal dicapai, dan kemudian kembali. Semasa pergerakan ini, ubah bentuk cantilever anjal (cantilever). Ketergantungan parameter ini pada jarak antara siasatan dan substrat dipanggil lengkung kekerasan. Dengan bantuannya, anda boleh menentukan magnitud kekuatan yang bertindak di antara objek yang sedang diteliti. Kaedah ini, dinamakan spektroskopi daya atom (ACC) boleh digunakan untuk mengkaji ciri-ciri kuasa interaksi pelbagai objek kecil: dari nanopartikel bukan organik kepada virus dan sel hidup.

Kaedah spektroskopi daya atom membolehkan menentukan magnitud daya yang bertindak di antara objek yang dikaji. Untuk melakukan ini, satu objek tetap di hujung siasatan AFM, dan yang kedua adalah tetap pada substrat. Siasatan dikenakan pada permukaan substrat dan kemudian naik kembali. Ketergantungan ubah bentuk cantilever pada jarak antara siasatan dan substrat dipanggil kurva daya.

Peringkat awal jangkitan sel dengan virus adalah lekat (melekat) zarah virus (virion) ke permukaan sel, diikuti penembusan bahan genetik virus ke dalam sel. Proses ini, ditentukan oleh interaksi reseptor protein yang terletak di permukaan sel dengan protein permukaan virion, adalah penting untuk pembiakan virus. Dan, harus diperhatikan, dalam kebanyakan kes, tidak cukup dipelajari.

Prospek yang benar-benar menarik untuk penyelidikan ke arah ini membuka ACC.Dengan menetapkan satu zarah virus di hujung siasatan AFM, adalah mungkin untuk mengukur daya yang berlaku apabila zarah virus menyentuh permukaan sel, memeriksa ciri kinetik interaksi ini, dan juga menekan virion di dalam sel sambil memerhatikan dengan mikroskop cahaya yang kuat. Dalam eksperimen seperti itu, seorang penyelidik dari pemerhati pasif berubah menjadi peserta aktif dalam proses itu, melakukan manipulasi mekanikal objek nanoskale di bawah kajian – tidak satu pun dari jenis mikroskopi lain yang dapat memberikan peluang demikian.

Walau bagaimanapun, penetapan zarah virus tunggal pada hujung mikroskop tenaga atom adalah tugas yang sangat sukar. Untuk percubaan yang berjaya, banyak kerja persediaan diperlukan:

  • dapatkan penyediaan virus paling tulen dan paling pekat;
  • sediakan di hujung siasatan pendaratan saiz yang sesuai untuk pendaratan virion;
  • kimia mengaktifkan permukaan siasat untuk membentuk ikatan kovalen apabila dihubungkan dengan protein virus;
  • pastikan bahawa virion benar-benar dipasang pada siasatan, dan bukannya molekul protein bebas atau serpihan sel kecil, yang sentiasa ada dalam persediaan virus.

Penilaian kepekatan dan kesucian virus dadah biasanya dilakukan oleh mikroskopi elektron penghantaran. Pad di hujung siasatan AFM, yang biasanya dibuat daripada silikon atau nitridanya, dibentuk oleh pengimbasan jangka panjang silikon atau sapphire substrat untuk nilai-nilai yang besar sapu dan menekan kuasa siasat ke permukaan. Ilustrasi paling grafik mengenai proses ini adalah perubahan bentuk hujung pensil semasa lukisan intensif.

Kaedah yang mencukupi untuk pemantauan parameter geometri mikroskop daya atom probe (a) ketika membuat tapak pendaratan virion, adalah mikroskop elektron, kedua-dua pengimbasan dan tembus:b – platform di hujung siasatan untuk menanam zarah virus yang besar; dalam – Zarah seperti virus yang tetap di hujung siasatan. Transmisi mikroskopi elektron (JEM 1400, Jeol, Jepun)

Persoalan utama yang perlu dijawab apabila menafsirkan sebarang hasil spektroskopi daya atom boleh dirumuskan seperti berikut: "Kuasa antara objek yang diukur?"

Dengan piawaian mikroskopi,sel organisma yang lebih tinggi adalah objek yang agak besar (≈ 10 μm), oleh itu, ia dapat dilihat dengan jelas dalam mikroskop cahaya, dengan bantuan yang digunakan oleh mikroskop mikroskop atom. Tetapi bagaimana dengan siasatan itu sendiri, di hujung yang mana virion sepatutnya hadir? Sebenarnya, bukannya virion, boleh ada apa-apa: monolayer molekul protein, serpihan sel atau virion, agregat beberapa virion, pencemaran rawak, dan sebagainya. Selain itu, virion boleh dimusnahkan atau terlepas dari probe semasa pengukuran. Walau bagaimanapun, visualisasi siasatan dengan zarah virus oleh mikroskop elektron sebelum pengukuran kuasa tidak dapat diterima, kerana di bawah pengaruh pengeringan, vakum dan rasuk elektron, virion akan memperoleh perubahan yang tidak dapat dipulihkan.

Kaedah yang paling berkesan untuk menyelesaikan masalah ini adalah visualisasi hujung siasatan AFM menggunakan mikroskop elektron, dilakukan sebaik sahaja selepas pengukuran kuasa. Sekiranya zarah virus didapati di hujung yang terselamat dalam eksperimen, maka semua keraguan akan hilang.

Sepanjang lima puluh tahun yang lalu, hasil kerja titanik yang benar-benar dilakukan oleh mikroskopis elektron di seluruh dunia,Satu pengetahuan yang besar telah dikumpulkan dalam bidang aspek ultrastruktur bagi replikasi pelbagai virus. Penciptaan mikroskop bertenaga atom dan teknik spektroskopi daya memungkinkan untuk mendekati manipulasi mekanikal sewenang-wenang dengan zarah virus tunggal. Ini membawa kajian tentang interaksi virus dengan sel ke tahap yang berbeza – dari struktur ke kajian fungsional.

Dalam kes ini, spektroskopi daya atom bukan pesaing untuk mikroskop elektron, tetapi membuka arah penyelidikan bebas baru – nanomekanik daripada interaksi zarah virus dengan permukaan sel. Sangat mungkin pada masa akan datang, penemuan asas ke arah ini akan dibuat, sesuai dengan pencapaian mikroskop elektron pada pertengahan abad yang lalu.

Kajian tentang mekanisme pengikatan zarah-zarah virus dengan permukaan sel adalah kepentingan yang besar bukan hanya dari sudut sains asas, tetapi juga dalam konteks aplikasi praktikal. Pemahaman yang lebih terperinci mengenai mekanisme ini di peringkat molekul dapat memberikan kemanusiaan sebagai kunci untuk mewujudkan ubat anti-virus yang berkesan,melindungi sel daripada virus.

Penerbitan ini menggunakan foto pengarang

Sastera
1. Korneev D. V., Bessudnova E. V., Zaitsev B. N. Kajian interaksi TiO nanopartikel2 dan permukaan erythrocyte manusia oleh spektroskopi daya atom // UNZH. 2012. No 4. P. 73-77.
2. Mironov VL Asas pengimbasan mikroskopi siasatan. Nizhny Novgorod: IPM RAS, 2004. 182 p.
3. Alsteens D., Pesavent E., Cheuvart G. et al. Manipulasi bakteriafag yang terkawal menggunakan spektroskopi daya tunggal virus // ACSNANO. 2009. V. 3 (10). P. 3063-3068.
4. Alsteens D., Trabelsi H., Soumillion P., Dufrene Y. F. Pencitraan mikroskopi atom atom multiparmetrik bakteria tunggal membungkus bakteria hidup // Komunikasi alam semula jadi. V. 4. Nombor artikel: 2926.
5. Binnig G., Quate C. F., Gerber Ch. Mikroskop berkuasa atom // Fiz. Wahyu Lett. 1986. V. 56 (9). P. 930-933.
6. Cappella B., Dietler G. Kurva jarak tempuh oleh mikroskop berkuat kuasa atom // Melayari. Sci. Rep. 1999. V. 34. P. 1-104.
7. Malkin A.J., Plomp M., McPherson A. Membongkar mikroskopi tenaga atom // Kaedah Mol. Biol. 2005. V. 292. P. 85-108.


* Mikroskopi elektron penghantaran menggunakan sel cecair khas dan mikroskopi pengimbasan elektron pada tekanan atmosfera memungkinkan untuk menyiasat objek biologi tanpa penetapan, tetapi disebabkan oleh beberapa masalah teknikal dan resolusi spatial yang agak rendah, kaedah ini tidak digunakan secara meluas.


Like this post? Please share to your friends:
Tinggalkan Balasan

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: