Sistem imuniti prokariotik akan membantu menyunting gen • Vera Bashmakova • Berita sains mengenai "Unsur" • Genetik, Mikrobiologi

Sistem imuniti prokaryotik akan membantu menyunting genom

Rajah. 1. Kematangan crRNA dalam sistem CRISPR jenis I. Rantau CRISPR terdiri daripada urutan yang serupa dengan kira-kira 30 nukleotida panjang (pengulangan), dipisahkan oleh urutan yang berlainan, juga kira-kira 30 nukleotida panjang (spacers). Plot CRISPR dikelompokkan (kaset); Bilangan CRISPR dalam kaset dan jumlah kaset sangat berbeza di antara jenis bakteria dan arkea: arkea dalam kaset tunggal boleh mempunyai sebanyak 300-500 CRISPRs. Penggantian berbeza dalam pelbagai jenis prokariot; Bagi spacers, set mereka biasanya unik untuk setiap strain. Kaset CRISPR bersebelahan dengan apa yang dipanggil Cas-genyang membuat sumbangan serius terhadap kerja sistem CRISPR (untuk maklumat lanjut, lihat kapsyen dalam Rajah 2). Selepas transkripsi kaset CRISPR, salah satu protein Cas, endonuclease CasE, memotong prekursor RNA yang tidak matang lama ke dalam crRNA matang pendek; dalam crRNA yang terhasil, rajah (melampau) wilayah adalah sama dan berasal dari ulangan, dan tengahnya adalah unik dan dibentuk oleh spacer. Imej dari slaid untuk syarahan K. V. Severinov di Winter School, dengan pengubahsuaian

Walaupun prokariot adalah salah satu makhluk paling teratur di bumi (hanya virus yang lebih mudah), reka bentuk mereka mengagumkan dengan rahmat dan kesempurnaannya.Sebagai contoh, baru-baru ini di dunia saintifik, penemuan sistem CRISPR prokariotik, yang memberikan imuniti kepada virus dan plasmid, secara literal membuat revolusi. Kerja-kerja sistem ini dan hakikat bahawa kajian mereka boleh memberi kepada manusia, diberitahu dalam ceramahnya di Konstantin Viktorovich Severinov, Doktor Sains Biologi, yang diadakan di Sekolah Musim Panas Bioteku yang disokong oleh RVC, Dynasty Foundation dan RFBR.

Seksyen genom yang misterius

Pada akhir 1980-an, semasa percubaan pertama menjejaki genom Escherichia coli, para penyelidik Jepun telah menemui sesuatu yang luar biasa – segmen DNA yang mengandungi pelbagai ulangan yang sama, dipisahkan oleh segmen unik, yang tidak dikenali – spacers (Rajah 1, 2). Laman-laman yang sama mula ditemui di prokariote yang lain. Selepas satu siri nama-nama perantaraan, mereka akhirnya dipanggil CRISPR – Replikasi Palindromic Pendek Diasaskan Secara Berterusan Diasaskan, dikelompokkan oleh ulangan palindromik peraturan yang dipisahkan oleh jurang. Mereka mempunyai kira-kira 40% bakteria dan hampir semua arkea.

Rajah. 2 Kematangan crRNA dalam sistem CRISPR jenis II. Pendahularan lama yang tidak matang (pra-crRNA) terdiri daripada pengulangan bergantian (ditunjukkan hitam) dan spacer (ditunjukkan hijau). RNA bukan pengkodan yang disintesis secara berasingan (tracrRNA) pelengkap kepada bahagian replay. Ia menyertai pengulangan, yang membawa kepada pemotongan kawasan pengulangan menggunakan RNase III di hadapan protein Csn1. Ini adalah tahap pemprosesan pertama. Pada peringkat seterusnya, walaupun kepingan-kepingan yang belum dijelaskan sepenuhnya setakat ini akan terputus dari sisa yang dihasilkan, sebagai akibatnya crRNA telah matang sepenuhnya. Imej dari artikel Elitza Deltcheva et al., 2011. RNase III

Fungsi CRISPR telah lama tidak jelas. Walau bagaimanapun, faedah praktikal CRISPR diperolehi tanpa memahami peranan mereka: kerana set spacers adalah unik untuk setiap strain, mereka boleh digunakan untuk mengenal pasti strain; Sebagai contoh, ini adalah asas untuk kaedah spoligotyping mycobacterium tuberculosis, yang digunakan secara meluas dalam epidemiologi untuk mengenalpasti sumber patogen dan menentukan sumber jangkitan.

Tetapi kenapa sel KRISPR misteri itu sendiri? Fakta bahawa mereka begitu meluas dalam dunia prokariotik bermakna mereka melakukan sesuatu yang sangat penting yang hampir semua prokariota diperlukan. Tetapi apa? Tiada siapa yang tahu itu.

Petunjuk itu dapat bersembunyi di urutan nukleotida CRISPR, dan terutama dalam urutan unik, tapak tidak berulang – spacer.Malangnya, sehingga masa yang tertentu, kajian urutan nukleotida pendek ini tidak memberi sebarang keputusan. Ia seolah-olah bahawa spacers menyandi beberapa jenis abracadabra yang tidak sesuai dengan apa-apa, tidak menentukan apa-apa dan tidak memerlukan apa-apa.

Dan kira-kira sepuluh tahun yang lalu, satu perkara yang aneh dan pelik menjadi terang. Ternyata urutan spacer jenis prokariote ini mencurigakan seringkali serentak dengan urutan genom virus yang menjangkiti spesies ini. Kebetulan semacam ini mencadangkan bahawa sistem CRISPR adalah sejenis imuniti yang diperoleh prokariotik yang membolehkan anda mengingati musuh dan mengatasinya apabila anda kembali menginfeksi. Adalah baik untuk ambil perhatian bahawa bekas senegara kami Yevgeny Kunin memainkan peranan penting dalam penyelesaian fungsi CRISPR.

Sistem CRISPR: Kekebalan Prokaryotik yang diperolehi

Pada masa ini, beberapa jenis sistem CRISPR diketahui. Pertimbangkan terlebih dahulu operasi sistem CRISPR, ciri Escherichia coli. Esherichia coli.

Apabila menyalin kaset CRISPR, RNA bukan kod pendek diperoleh – crRNA, masing-masing terdiri daripada spacer yang dikelilingi oleh dua tapak pengulangan (Rajah 1).Sekiranya sel dijangkiti virus, urutan DNA yang bersifat komplementer terhadap urutan salah satu sprektor crRNA, maka sel itu dapat bertahan dalam jangkitan.

Spacer crRNA disambungkan ke rantau DNA virus komplementer – protospeacer melalui kompleks protein Cas-spesifik (ini juga memerlukan urutan nukleotida pendek – PAM, motif yang berkaitan dengan protospacer) dalam DNA asing. Selepas itu, satu lagi protein cas, Cas3, endonuclease / helicase, berenang ke kompleks yang dihasilkan, yang memperkenalkan rehat dua stranding ke dalam DNA virus (Rajah 3, B). Akibatnya, DNA asing rosak, jangkitan virus berhenti, dan sel "menang" dan masih hidup.

Rajah. 3 Mekanisme sistem CRISPR jenis I dan II. Dalam jenis sistem I (turun di bawah) sebilangan besar komponen terlibat dalam proses pemotongan. crRNA mengikat kompleks protein tambahan besar yang dipanggil Cascadeyang dibentuk oleh sesetengah cas-proteins (gen-gen protein yang membentuk kompleks ini ditunjukkan dalam Rajah 1 kuning). Mencari urutan DNA pelengkap (Protoseiser), crRNA menggunakan Cascade bergabung dengannya; ia menyebabkan pengaktifan enzim Cas3 (Pengkodan gen ditunjukkan dalam Rajah 1. oren), yang memotong DNA asing dan dengan itu menjimatkan sel. Dalam sistem jenis II (di bahagian atas) kurang komponen: kompleks tracrRNA-crRNA mengikat ke rantau proto-spacer DNA asing, dan enzim Cas9 memotong kedua helai DNA ini dengan domain HNH dan RuvC mereka. Perhatikan bahawa dalam kedua-dua kes itu, untuk crRNA untuk menyertai protospacer, terdapat seksyen pendek yang dipanggil PAM (motif pelindung protospaser; dalam angka ini ia hanya dipanggil motif). Imej dari Stan J. J. Brouns, 2012. Pisau Tentera Swiss Kekebalan

Kerja sejenis sistem CRISPR, yang biasa, sebagai contoh, bagi bakteria Streptococcus thermophilusdigunakan untuk pengeluaran banyak produk asid laktik, tetapi komponen di dalamnya lebih kecil dan lebih mudah untuk struktur. Kematangan crRNA disediakan oleh RNA bukan pengkodan (trans-activating crRNA atau tracrRNA), laman ulangan yang melengkapi, dan enzim selular secara luas yang diedarkan RNase III (lihat Ribonuclease III), serta protein tambahan Csn1 (Gambar 2). Serangan terhadap DNA asing dilakukan menggunakan tracrRNA yang sama dan endonuclease Cas9 (Gamb.3, A).

Sistem perlindungan virus prokariotik CRISPR sangat mirip dengan sistem gangguan RNA eukariotik, yang turut mengambil bahagian dalam perlindungan antivirus dan menggunakan teknik yang sama – melampirkan kawasan RNA pelengkap yang pendek kepada mRNA yang tidak diingini dan kemudian mematikan mRNA yang tidak perlu dalam satu atau lebih cara. (contohnya, anda boleh memotongnya).

Selalunya, crRNAs berjaya menyambung walaupun dengan urutan DNA komplementer yang tidak lengkap, dengan syarat terdapat kawasan PAM yang sesuai dan permulaannya protospacer adalah sepenuhnya pelengkap kepada urutan spacer (Rajah 4). Oleh itu, satu spacer secara serentak dapat memberikan perlindungan terhadap beberapa virus yang serupa. Ini mudah dan membolehkan anda menjimatkan ruang dalam genom prokariotik kecil.

Rajah. 4 Skim untuk mengikat crRNA kepada DNA asing. Untuk mengikat ini, cukup bahawa hanya bahagian awal proto-spacer adalah pelengkap (ia dipanggil benih) dan di hadapan protopacer terdapat PAM "betul". Imej dari Semenova et al., 2011. Gangguan oleh clustered RRNA palatromik yang kerap berpanjangan secara rawak (CRISPR) RNA ditadbir oleh urutan benih

Walau bagaimanapun, apa yang perlu dilakukanjika sel tidak pernah bertemu dengan virus ini sebelum dan tidak mempunyai crRNA dengan spacer mengenalinya? Adakah dia ditakdirkan? Akankah virus benar-benar menang dalam kes ini?

Tidak betul. Sudah tentu bkira-kiraKebanyakan bakteria "naif" akan dimusnahkan oleh virus. Walau bagaimanapun, sesetengah sel berjaya mengatasinya – dan ini adalah bagaimana (Rajah 5): sel-sel bakteria yang dijangkiti virus mula memusnahkan semua DNA yang datang ke tangan (atau sebaliknya, di bawah enzim) dan memasukkannya ke dalam kaset CRISPR sebagai spacer (peranan penting dalam proses ini, dua lagi protein Cas sedang bermain – Cas1 dan Cas2).

Rajah. 5 Skim akhir sistem CRISPR mengenai contoh jangkitan bakteria E. coli phage M13.
1. Semuanya bermula dengan fakta bahawa phage menyerang bakteria yang tidak berpengalaman yang belum pernah dijumpai dengan patogen ini dan menyuntikkan DNA ke dalamnya. (Gambar menunjukkan hanya satu phage menyerang dan hanya satu cincin DNAnya yang ada di dalam sel, tetapi sebenarnya phage menyerang dan DNA yang disuntikkan oleh mereka jauh lebih besar.) Sebagai tindak balas, bakterium dengan bantuan protein Cas1 / Cas2 mula dipotong dengan demamasemua segmen DNA yang telah dijumpai – kedua-dua phage dan mereka sendiri, tuan rumah – dan memasukkannya sebagai spacer ke CRISPR.Jika bakterinya bertuah dan mereka memotong sekeping DNA yang betul, maka …
2. Jangkitan akan mencetuskan tindak balas terhadap crRNA yang sepadan, Cascade complex dan Cas3 (ditunjukkan secara terperinci dalam Angka 2 dan 3), dengan hasil bahawa DNA phage akan dimusnahkan. Walau bagaimanapun, phages juga tidak dibakar dengan buruk, mereka juga mahu memenangi perang ini. Ia adalah mutasi mutasi (mutasi yang ditunjukkan) titik merah), kerana crRNA akan berhenti mengenali mereka, dan mereka tidak kelihatan akan menembusi sel dan mula melakukan kerja kotor mereka. Ia seolah-olah sel telah ditakdirkan, tetapi …
3. Bahkan sekeping DNA phage yang tidak lengkap yang mengaktifkan sistem CRISPR, dan pemotongan fragmen DNA akan dibuat dari DNA phage. Rupa-rupanya, ini dipastikan oleh fakta bahawa kompleks Cas1 / Cas2, walaupun crRNA adalah tidak lengkap sepenuhnya kepada DNA phage, mula mencerobohi DNA yang memusnahkan ini, memotongnya satu demi satu sehingga ia mencapai bahagian yang sesuai untuk "betul" Spacer. Spacer ini akan menyelamatkan sel dari jangkitan.
Imej dari artikel Kirill A. Datsenko et al., 2012. Memori molekul mengaktifkan sistem imunisasi bakteria CRISPR / Cas adaptif

Bkira-kirakebanyakan plot yang dimasukkan tidak berguna atau bahkan berbahaya (contohnya,penyisipan sebagai bahagian "potret musuh" DNA bakteria akan mengakibatkan kematian sel akibat DNA raskus sendiri); Walau bagaimanapun, beberapa "yang bertuah" secara tidak sengaja memasukkan serpihan DNA virus sebagai spacer CRISPR, yang memungkinkan untuk mensintesis crRNA pelindung dan mengalahkan virus. Mereka akan menghantar spacer baru ini kepada semua keturunan mereka, dan oleh itu keturunan mereka akan dilindungi dari virus ini. Secara umum, set spacer dalam sel ini, dalam ertikata, sejarahnya, kenangan sebelumnya, menang, pertempuran dengan virus.

Tetapi itu bukan semua. Ternyata penyisipan spacer berlaku pada prinsip umpan balik positif, iaitu penyisipan satu spacer dengan tajam merangsang pemasukan spacer berikutnya dari DNA penderma. Oleh itu, eksperimen yang dilakukan di makmal K. V. Severinov menunjukkan bahawa jika bakteria diberi mempunyai spacer untuk virus tertentu, jangkitan semula dengan virus ini menyebabkan penunjuk arah tambahan spacer dari DNA virus. Dalam erti kata lain, jika bakteria telah diserang oleh virus sebelum ini, ia akan memindahkan serangan seterusnya dengan lebih mudah, kerana ia akan mempunyai keupayaan untuk mengenal pasti DNA asing dan memasukkan spacer baru. Sesuatu seperti suntikan, bukan?

Permohonan praktikal

Apakah faedah praktikal yang boleh diperoleh daripada pengetahuan mengenai operasi sistem CRISPR? Besar, dan dalam pelbagai bidang.

Mari kita mulakan dengan fakta bahawa sel prokariotik digunakan secara aktif oleh orang untuk pelbagai perkara – mengambil sekurang-kurangnya semua bakteria tenusu yang diketahui. Sudah jelas bahawa salah satu perkara paling dahsyat yang boleh terjadi semasa pengeluaran produk susu yang ditapai adalah serangan bakteria yang menghancurkan budaya bakteria. Walau bagaimanapun, jika kita tahu cara melindungi bakteria daripada serangan ini, maka tidak akan ada masalah dengan pengeluaran produk tenusu.

Pada masa yang sama, bakteria lain, sebaliknya, boleh mendatangkan bahaya yang serius kepada manusia, haiwan atau tumbuh-tumbuhan. Walau bagaimanapun, jika kita tahu bagaimana ia dilindungi daripada serangan bakteria, maka kita boleh menghalang mereka daripada melakukannya – dan melarikan diri dari jangkitan bakteria.

Akhirnya, ada yang ketiga, sangat menjanjikan, penerapan sistem CRISPR. Ia boleh digunakan untuk menyunting genom organisma yang lebih tinggi, termasuk manusia, dengan ketepatan yang belum pernah terjadi sebelumnya. Ini baru-baru ini menerbitkan dua artikel dalam Sains (Le Cong et al., 2013. Kejuruteraan genom Multiplex Menggunakan Sistem CRISPR / Cas; Prashant Mali et al., 2013. Kejuruteraan Genom Manusia RNA-dipandu melalui Cas9), dan saya akan memikirkannya dengan lebih terperinci.

Gunting genom yang paling tepat

Untuk "mengedit" beberapa tempat dalam DNA, sebagai contoh, untuk membetulkan mutasi yang membawa kepada penyakit genetik, anda mesti terlebih dahulueuntuk memanggil. Pada masa yang sama, enzim pemotongan – endonuclease – mesti mempunyai kekhususan tertinggi, iaitu, untuk memotong DNA di tempat yang betul dan hanya di dalamnya (kerana memotong DNA dalam tidak perlu lokasi boleh membawa kepada sepenuhnya tidak perlu akibatnya). Ini bermakna bahawa segmen DNA di mana tempat yang diperlukan ini diiktiraf mesti selagi mungkin – kerana semakin lama, semakin kecil kemungkinannya bahawa rantau yang sama akan berlaku di tempat lain dalam genom dan gunting endonuclease juga akan disiarkan di sana.

Dan sejak kompleks perlindungan sistem CRISPR dikaitkan dengan relatif panjang (sekurang-kurangnya 20 nukleotida) segmen DNA sepadan dengan spacers, ia menjadi mungkin untuk mencapai kekhususan penyuntingan yang tinggi.

Untuk asas perkembangan mereka, kedua-dua kumpulan penulis diterbitkan di dalam Sains artikel hanya mengambil sistem dari Streptococcus thermophilusterdiri daripada hanya empat elemen wajib – tracrRNA, crRNA, RNase III dan Cas9 (Rajah 3, A). Kurangnya komponen, lebih mudah untuk bekerja dengan sistem dan lebih tinggi peluang bahawa sistem akan berfungsi dalam keadaan kerja yang tidak standard dalam sel eukariotik.Penyelidik berjaya menyederhanakan sistem ini. Pertama, mereka mencipta "chimeric" tracr-crRNA, yang tidak lebih buruk daripada tracrRNA dan crRNA yang disintesis secara berasingan (Rajah 6). Kedua, mereka mendapati bahawa bakteria RNase III tidak diperlukan untuk sistem berfungsi, kerana fungsinya boleh dilakukan oleh Rnases "tempatan", yang disintesis dalam sel eukariotik.

Rajah. 6 RNA "chimeric" mempunyai semua serpihan utama crRNA dan tracrRNA yang diperlukan untuk berfungsi dengan betul dalam sel: urutan panduan (tapak spacer yang paling penting yang mengikat DNA) dan laman web berulang yang dikaitkan dengan sepotong tracrRNA. "Chimera" semacam itu lebih mudah dalam struktur daripada dua molekul berasingan crRNA dan tracrRNA, dan berfungsi lebih kurang dengan kecekapan yang sama. Imej dari artikel Le Cong et al., 2013. Kejuruteraan Genom Multiplex Menggunakan CRISPR / Sistem Cas. Penyelidik dari kumpulan kedua menerima struktur yang sama (Prashant Mali et al., 2013. Kejuruteraan Genom Manusia RNA-Dipandu melalui Cas9)

Oleh itu, untukeuntuk meletakkan DNA dalam sel di tempat yang betul, anda terpaksa berbuat sedikit:

1) Masukkan urutan yang melengkapkan "tempat yang betul" ini sebagai spacer dalam kaset CRISPR dan dapatkan tracr-crRNA chimeric.

2) Jalankan ungkapan iniKaset CRISPR dan protein Cas9 dalam sel yang sama, memberikan mereka dengan isyarat lokalisasi nuklear (NLS), supaya mereka tidak "melekat tanpa rasa" ke atas sitoplasma, tetapi terapung terus ke dalam nukleus, di mana, sebenarnya DNA yang dipotong terletak.

Sistem yang dihasilkan dalam kerja pada budaya sel menunjukkan hasil yang sangat baik: dengan bantuannya, anda boleh membuang beberapa bahagian dari DNA dan memasukkan kawasan baru di sana. Sistem CRISPR menunjukkan prestasi yang lebih baik daripada kegemaran terdahulu di kawasan ini – nukleus jari jari zink (lihat jari-jari nuk silakan) dan TALEN. Sudah tentu, tidak mustahil, untuk mengatakan bahawa sistem CRISPR akan membolehkan anda melakukan dengan genom semua yang dilakukan oleh penyelidik, tetapi, mungkin, dari semua teknik yang ada, paling dekat dengan ini.

Sumber:
1) Kuliah oleh K. V. Severinov di FutureBiotech Winter School.
2) Le Cong, F. Ann Ran, David Cox et al. Kejuruteraan Genom Multiplex Menggunakan Sistem CRISPR / Cas // Sains. V. 339. P. 819-823.
3) Prashant Mali, Luhan Yang, Kevin M. Esvelt. Kejuruteraan Genom Manusia berpandu RNA melalui Cas9 // Sains. V. 339. P. 823-826.
4) John van der Oost. Alat Baru untuk Pembedahan Genom // Sains. V. 339. P. 768-770 (sinopsis untuk dua artikel di atas).
5) Kirill A. Datsenko, Ksenia Pougach, Anton Tikhonov et al. CRISPR / Cas ketahanan sistem bakteria // Komunikasi alam semula jadi. V. 3. Nombor artikel: 945. Diterbitkan pada 10 Julai 2012.
6) Ksenia Pougach, Ekaterina Semenova, Ekaterina Bogdanova et al. Transkripsi, Pemprosesan dan Fungsi CRISPR Kaset di Escherichia coli // Mikrobiol mol. V. 77. P. 1367-1379.

Vera Bashmakova


Like this post? Please share to your friends:
Tinggalkan Balasan

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: