Sistem CRISPR-CAS9 berjaya diambil gambar dalam tindakan • Anastasia Pashutova • Berita Sains mengenai "Elemen" • Biologi Molekul, Genetik

Sistem CRISPR-CAS9 berjaya menembak dalam tindakan

Rajah. 1. Mekanisme sistem Crispr-Cas. 1 – Segmen DNA virus yang pertama kali dijumpai sel (merah) dimasukkan ke dalam lokus CRISPR, di mana segmen DNA virus yang sel sebelumnya telah dijumpai telah disimpan (anak panah yang berwarna-warni). 2 – berdasarkan perpustakaan CRISPR, panduan RNA dicipta, yang membentuk kompleks dengan protein Cas (oval ungu). 3 – Apabila kompleks Cas-RNA memenuhi DNA virus (hijau), pelengkap kepada RNA panduan, ia menghubungkan dengannya dan memusnahkan, memotong. Imej dari gesundheitsindustrie-bw.de

Walaupun sudah lebih dari sepuluh tahun sejarah mengkaji sistem CRISPR-Cas dan menggunakannya untuk menyunting genom, setakat ini tiada siapa yang memerhatikannya di tempat kerja. Para saintis Jepun telah menghapuskan jurang ini dan merupakan yang pertama di dunia untuk mendapatkan video proses ini menggunakan mikroskop berkekuatan atom berkelajuan tinggi. Ternyata unsur-unsur sistem mengikat molekul DNA dengan cara yang berbeza daripada yang difikirkan sebelum ini: mereka tidak merangkak di sepanjang molekul-molekul ini untuk mencari tempat yang tepat, tetapi mencari dengan bantuan penyebaran tiga dimensi.

Sistem CRISPR-Cas9, yang digunakan untuk penyuntingan genom yang diarahkan, telah mendapat populariti di kalangan saintis.Bilangan artikel yang menyebutkan sistem ini berkembang pesat setiap tahun (bermula dengan beberapa artikel pada tahun 2011 dan berakhir dengan lebih daripada dua ribu artikel pada tahun 2017).

Ingat bahawa CRISPR-Cas adalah sistem kekebalan bakteria. Seperti sistem imun kita, yang mempunyai:
1) sel memori, tugas yang mengingati "musuh" di muka dan menyimpan maklumat tentangnya (contohnya, populasi limfosit khas menyimpan maklumat mengenai senjata sebelum ini terhadap ejen berjangkit dan membentuk tindak balas imun sekunder);
2) sel-sel yang akan secara langsung melawan musuh (contohnya, T-pembunuh);
Bakteria juga mempunyai mekanisme yang bertujuan untuk menghapuskan agen-agen berjangkit. Hanya dalam bakteria, sel individu tidak bertanggungjawab terhadap imuniti, tetapi asid nukleat (DNA dan RNA) dan protein yang disesuaikan khas untuk tujuan ini. CRISPR (dikelompokkan secara berkala diulang palindromic pendek), kompleks segmen DNA berulang, mendasari sistem imun bakteria. Di antara mereka terdapat spacer – pemisah dengan serpihan genom virus – genetika "potret" mereka yang telah mengalami bakteria ini. Ini adalah asas pelik identikit pelanggar dalam genom bakteria.

Ia berfungsi seperti ini.Sekiranya virus yang tidak pernah dilihat sebelum ini dan berjaya melawan bakterium, maka ia akan meninggalkan sekeping DNA virus dalam ingatan, yang akan disimpan di lokus CRISPR (Rajah 1). Selepas itu, perlu untuk menerjemahkan urutan nukleotida yang diperolehi daripada virus ke dalam bentuk yang mampu mensasarkan protein Cas. Untuk ini, RNA panduan yang dipanggil (gRNA) dibuat, yang mengulangi sekeping DNA virus yang dimasukkan ke dalam pangkalan. Sebagai peraturan, panduan RNA dicipta secara berterusan dan pada kelajuan yang agak rendah, tetapi apabila sel bertembung dengan virus atau dalam keadaan yang tertekan, kelajuan meningkat dengan ketara. Selepas RNA dicipta, ia terikat kepada kompleks protein Cas. Kini kompleks Cas-gRNA, seperti seorang anggota polis dengan identikit seorang jenayah, boleh meronda sel. Apabila sekeping DNA asing ditemui yang melengkapi RNA panduan, kompleks mengikat bahagian ini dan protein Cas mengikatnya seperti sepasang gunting molekul. Untuk maklumat lanjut mengenai mekanisme molekul ini, lihat, contohnya, artikel D.E. Dzhagarov, Gunting Pintar untuk DNA.

Ditemui hampir 30 tahun yang lalu, selama lebih dari 20 tahun, sistem ini hanya tertarik kepada ahli biologi molekul yang cuba memahami sifat-sifat mekanisme perlindungan unik ini.Pada tahun 2012, potensi sistem CRISPR-Cas9 telah dikenal pasti sebagai alat untuk menyunting genom yang boleh memulakan pengubahsuaian genetik yang disasarkan dalam hampir mana-mana organisma. Dalam tahun-tahun berikutnya, dengan menggunakan kaedah ini, para saintis mengurus, sebagai contoh, untuk menghilangkan tikus penyakit genetik (JR Mendell, LR Rodino-Klapac, 2016. Dystrophy muscle distrofi: rawatan CRISPR / Cas9) untuk menyembuhkan haiwan daripada HIV (C. Yin et al. 2017. Dalam Pengasingan Vivo RNA Single-Guide dalam Model Haiwan, dan juga menyunting genom embrio dan dewasa (lihat P. Liang et al., 2015. Pengeditan gen CRISPR / Cas9 di dalam zygotes tripronuklear manusia dan nota terkenal D. Cyranoski saintis Cina untuk merintis percubaan CRISPR pertama manusia). Baca tentang sejarah dan hasil utama menerapkan kaedah ini dalam berita. Hasil kajian dekad pertama CRISPR disimpulkan ("Elements", 13.07.2017).

Walaupun kemajuan yang ketara, sehingga hari ini belum ada satu pemerhatian langsung mengenai fungsi sistem ini. Jurang ini dihapuskan oleh sekumpulan saintis Jepun yang diketuai oleh Mikihiro Shibata (Mikihiro Shibata) menggunakan mikroskop berkekuatan atom berkelajuan tinggi (HS-AFM), yang membolehkan molekul pengimejan dan juga atom individu. Artikel mengenai kajian yang diterbitkan dalam jurnal Komunikasi alam semula jadi.

Dengan bantuan pengimejan HS-AFM, dinamik protein dapat dikenal pasti dengan terperinci yang hebat.Sebagai contoh, saintis terdahulu, di antaranya adalah beberapa pengarang kerja yang sedang dibincangkan, berjaya menangkap gambar perubahan konformasi dalam molekul bacteriorhodopsin (M. Shibata et al., 2010. mikroskopi molekul atom dan memerhatikan molekulnya). myosin, berjalan melalui filamen actin (N. Kodera et al., mikroskop berkuasa atom berkelajuan tinggi).

Prinsip pengoperasian mikroskop berkuat kuasa atom adalah berdasarkan interaksi antara interaksi antara permukaan sampel dan probe. Siasatan adalah tip nano yang terletak pada ujung cantilever anjal. Permukaan yang diimbas dapat menarik atau mengusir siasatan, yang menyebabkan cantilever bengkok (Gambar 2). Selekoh ini didaftarkan dengan bantuan laser, yang dipantulkan dari cantilever, memukul pengesan foto sensitif (lihat artikel A. Kuramshin untuk butirannya. Lihat atom, sentuh molekulnya). Mikroskop berkuasa atom berkelajuan tinggi berfungsi dengan prinsip yang sama. Satu-satunya perbezaan adalah bahawa cantilever digunakan, yang beribu-ribu kali lebih kecil daripada yang digunakan dalam AFM klasik, yang membolehkan meningkatkan kelajuan pengambilalihan imej.

Rajah. 2 Skim mikroskop kuasa atom. Imej dari simple.wikipedia.org

Para saintis sendiri telah menyediakan molekul yang diperlukan untuk kajian ini. Protein Cas9 disintesis dalam sel E. coli. E. colidan kemudian disucikan oleh kromatografi lajur. Penargetan RNA dan DNA sasaran disintesis dalam vitro. Di samping itu, satu substrat khas disediakan di mana biopolimer kemudian diletakkan. Keperluan berikut dikemukakan untuk substrat yang digunakan untuk AFM: permukaan mesti cukup lancar dan diserap dengan baik objek yang sedang dikaji. Apabila mengimbas biomolekul yang paling sering digunakan oleh substrat mika. Dan walaupun substrat tersebut mempunyai permukaan hidrofilik dengan bahagian atom yang lebih besar daripada 100 mikron, mereka mempunyai beberapa kekurangan – contohnya, caj permukaan negatif (yang boleh mengganggu DNA, kerana kumpulan fosfat juga mempunyai caj negatif) dan keupayaan untuk menindas penyebaran bebas kompleks. Untuk mengatasi kekurangan ini, penyelidik mengubahsuai permukaan mika dalam dua cara yang berbeza:
1) merawat permukaan mika dengan larutan APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilane), hasilnya sebuah filem terbentuk di permukaan mika, yang mempunyai cas positif di dalam air.
2) lipid bilayer dibentuk pada permukaan mika, kerana interaksi antara kompleks Cas9-RNA dan mika diminimumkan.

Perkara pertama yang dilakukan saintis Jepun adalah cuba memfoto protein Cas9 tanpa mengarahkan RNA. Sebelum ini, perubahan dalam protein Cas9 yang berlaku semasa operasi telah dikaji menggunakan analisis difraksi sinar-X (PCA). Kaedah ini membolehkan seseorang memperoleh struktur tiga dimensi molekul, contohnya, protein (lihat A. Oganov, 10 fakta mengenai kristalografi). Ringkasnya, proses mendapatkan imej dengan kaedah ini terdiri daripada langkah-langkah berikut: membuat penyelesaian protein tepu yang telah melalui proses pembersihan, proses penghabluran sampel, mengumpul data hamburan x-ray dan memproses data secara langsung, termasuk simulasi komputer.

Kajian terdahulu menunjukkan bahawa molekul Cas9 dalam keadaan bebas mempunyai struktur yang tegar. Untuk menguji ini, saintis Jepun mengambil model kristal yang diperoleh oleh sekumpulan penyelidik yang lain, dan membandingkannya dengan imej mereka yang diperolehi di AFM. Ternyata protein bebas mempunyai struktur mudah alih yang berbeza dari struktur tegar yang diamati dalam kristal (Rajah 3, b, c).Iaitu, data yang diperoleh lebih awal menggunakan XRD ternyata tidak relevan, kerana mereka tidak sesuai dengan struktur protein dalam keadaan semula jadi.

Rajah. 3 b– Struktur kristal, dari kiri ke kanan: Cas9-RNA tunggal, kompleks Cas9-RNA, Cas9-RNA, dikaitkan dengan DNA target satu stranding dan Cas9-RNA, yang dikaitkan dengan sasarannya (DNA double-stranded). Warna yang berbeza domain fungsi yang ditetapkan bagi protein: sekeping putih kelabu – bilah alpha-spiral, merah jambu – domain nuclease HNH, yang memecahkan DNA sasaran, biru – domain nukleus RuvC, yang melonggarkan rangkaian DNA yang tidak ditargetkan, beige – Domain PAM mengenal pasti DNA sasaran khas. c dan d – imej berurutan yang diperoleh dengan mikroskop berkekuatan atom berkelajuan tinggi: single Cas9 (c) dan kompleks Cas9-RNA ( d ). Ekor kecil ditunjukkan anak panah, ini adalah sekeping RNA yang menonjol dari lobus helai alfa. Skala di sebelah kanan tunjukkan ketinggian objek di atas substrat. Imej dari artikel dalam perbincangan Komunikasi alam semula jadi

Kemudian penyelidik memfiluskan kompleks Cas9 dengan panduan RNA. Tidak seperti protein tunggal, kompleks Cas9-RNA mempunyai seni bina bilobed yang stabil sepadan dengan struktur kristal (Rajah 3, b, d, lihatjuga video No. 2 dari bahan tambahan kepada artikel yang dibincangkan).

Langkah seterusnya adalah visualisasi pengikatan kompleks Cas9-RNA kepada DNA sasaran. Untuk memulakan, semua "peserta" diserap ke permukaan substrat: kompleks molekul Cas9-RNA dan sasaran DNA. Dalam video, anda dapat melihat bahawa kompleks Cas9-RNA secara khusus mengikat sasaran DNAnya. Semua ini dilakukan tanpa adanya ion magnesium Mg2+. Ion logam ini diperlukan untuk operasi nukleas yang betul, oleh itu kompleks mengikat DNA tanpa magnesium, tetapi tidak ada lagi pemisahan (Rajah 4; lihat juga video No. 3 dari bahan tambahan untuk artikel yang dibincangkan).

Rajah. 4 Kompleks Cas9-RNA, khususnya (iaitu, di lokasi tertentu di mana pemotongan akan berlaku) yang berkaitan dengan sasarannya jika tiada ion Mg2+, tidak memotong DNA. Imej dari artikel dalam perbincangan Komunikasi alam semula jadi

Untuk memvisualisasikan proses pemecahan DNA, para penyelidik mengulangi langkah sebelumnya, tetapi telah menambahkan magnesium. Kemudian protein Cas9 mampu memotong DNA. Video menunjukkan bagaimana, selepas memasukkan rehat dua stranded, sebahagian daripada DNA dibebaskan dari kompleks (Rajah 5 dan video).

Rajah. 5 Kompleks Cas9-RNA dengan kehadiran ion Mg2+ memotong DNA. Anak panah putih dan merah jambu nyatakan domain silakan NHN dalam keadaan tidak aktif dan aktif. Dikeluarkan akhir helai DNA ditunjukkan. anak panah biru pada bingkai terakhir. Imej dari artikel dalam perbincangan Komunikasi alam semula jadi

Complex Cas9-RNA memotong molekul DNA

Oleh kerana kekurangan resolusi imej, malangnya, ia masih tidak diketahui bagaimana bahagian yang tersisa dari molekul DNA di kompleks dikeluarkan.

Para saintis juga berjaya membantah teori bagaimana tepatnya kompleks Cas9-RNA mengikat wilayah yang diperlukan pada molekul DNA: sebelum ini percaya bahawa protein terikat kepada RNA "slaid" di sepanjang DNA untuk mencari kawasan pelengkap. Untuk tujuan ini, penyelidik menggunakan substrat berasaskan bilipid untuk meminimumkan interaksi antara mika dan protein, yang boleh mengganggu penyebaran kompleks kompleks. Ternyata Cas9 tanpa panduan RNA mengikat ke molekul DNA dan hanya meluncur bersama-sama. Tetapi apabila protein mempunyai RNA yang melengkapi tapak yang dikehendaki, kompleks tidak tergelincir, tetapi secara langsung dikaitkan dengan sasaran (Rajah 6, lihat juga video No. 7 dari bahan tambahan untuk artikel yang dibincangkan). Ternyata, kehadiran panduan RNA menghalang kompleks Cas9-RNA dari "mengangkang" DNA untuk meluncur bersama-sama.Oleh itu, pengikatan berlaku kerana penyebaran tiga dimensi: kompleks mengapung dalam larutan, dan jika mereka bernasib dekat dengan segmen DNA yang dikehendaki, mereka mengikatnya.

Rajah. 6 a – beberapa protein Cas9 (ditandakan anak panah), yang kekurangan RNA mengarahkan, slaid di sepanjang molekul DNA. b – kompleks Cas9-RNA segera mengikat ke tapak yang dikehendaki, sebaik sahaja ia bersebelahan dengan penyebaran tiga dimensi. Di dalam kerangka kedua, beberapa molekul DNA dilihat, di mana kompleks Cas9-RNA sudah duduk (anak panah bawah), dan di tempat lain ada tempat yang kompleks lain akan dihubungi (anak panah teratas). Dalam bingkai keempat dan kelima, jelas terlihat bahawa Cas9-RNA muncul di tempat yang betul sekaligus, dan tidak meluncur di sepanjang DNA. Imej dari artikel dalam perbincangan Komunikasi alam semula jadi

Video-video kasar dan nampaknya membuat para saintis mengelilingi dunia dengan gembira. Dalam satu tangan, sistem CRISPR-Cas9 berfungsi seperti yang diramalkan lebih awal. Sebaliknya, butiran baru telah menyedari bagaimana kompleks protein mengikat segmen DNA yang betul. Secara umum, kajian ini memberikan butiran terperinci tentang dinamik fungsi CRISPR-Cas9 dan menggariskan potensimikroskopi berkekuatan atom berkelajuan tinggi untuk menentukan mekanisme tindakan molekul yang berkaitan dengan asid nukleik.

Sumber: Mikihiro Shibata, Hiroshi Nishimasu, Noriyuki Kodera, Seiichi Hirano, Toshio Ando, ​​Takayuki Uchihashi & Osamu Nureki. Krisis real-time CRISPR-Cas9 dinamik masa nyata yang divisualisasikan oleh mikroskop berkuasa atom berkelajuan tinggi // Komunikasi alam semula jadi. 2017. DOI: 10.1038 / s41467-017-01466-8.

Anastasia Pashutova


Like this post? Please share to your friends:
Tinggalkan Balasan

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: