Sel E. coli dapat mencari dan memusnahkan herbisida atrazine • Vera Bashmakova • Berita Sains mengenai "Elemen" • Genetik

Sel-sel E. coli dapat mencari dan memusnahkan herbisida atrazine

Struktur kimia atrazine. Imej dari en.wikipedia.org

Mimpi setiap ahli sains yang terlibat dalam biologi sintetik adalah untuk memprogram semula sel supaya mereka boleh melaksanakan tugas-tugas kompleks secara berasingan – contohnya, mensintesis atau, sebaliknya, memecahkan beberapa bahan. Secara beransur-ansur, impian ini mula menjadi kenyataan: sel-sel E. coli mutan baru-baru ini dicipta (Escherichia coli), yang mengenali racun herba, bergerak ke tempat penyetempatannya dan memusnahkannya.

Oleh kerana atrazin tiada kaitan dengan E. coli, kerja itu terdiri daripada dua bahagian. Pertama, adalah perlu untuk "mengajar" bakteria untuk mengenali atrazine dan bergerak ke arahnya (gerakan ini dipanggil pseudotaxis, dengan analogi dengan chemotaxis). Kedua, bakteria harus mendapatkan "senjata untuk menghancurkan" herbisida (iaitu enzim yang membelahnya).

E. coli mempunyai seluruh sistem sensor protein untuk mengesan pelbagai bahan kimia – asid amino, dipeptida dan gula. Pada dasarnya, adalah mungkin untuk cuba "membuat semula" salah satu sensor supaya ia bertindak balas kepada atrazine, tetapi penyelidik memutuskan untuk pergi sebaliknya dan "seret" pada herbisida ini, bukan protein tetapi molekul RNA.

Untuk ini, teknologi SELEX telah digunakan.Kaedah pemilihan ini dipilih dari raksasa (lebih daripada 1014 ahli) perpustakaan urutan RNA yang secara khusus dan sangat terikat kepada ligan yang diperlukan (urutan RNA, DNA atau protein disebut aptamers; lihat Aptamer). Berdasarkan aptamer yang dihasilkan, riboswitches dicipta – urutan RNA yang bergantung kepada ligand bergantung kepada ekspresi gen tanpa bantuan cofactor protein. Kemudian terdapat banyak pilihan: anda boleh memaksa sel untuk memasukkan bahan asing kepada metabolisme mereka, mengajar mereka untuk bergerak ke arah beberapa molekul, atau sebaliknya, "lari" dari mereka, dan sebagainya.

Malangnya, ia sering berlaku bahawa riboswitch, diperolehi berdasarkan aptamer dengan pertalian yang tinggi untuk ligan, untuk sebab tertentu ternyata "tidak berfungsi" dan tidak boleh menyebabkan reaksi yang diperlukan dalam sel. Adalah agak sukar untuk meramalkan "kecekapan" dari pengguna dalam perkara ini. Oleh itu, para penyelidik memilih untuk mendapatkan perpustakaan besar aptamers dengan pertalian rata-rata untuk atrazine dan bukannya mencari aptamer tunggal dengan afiniti tinggi.

Seterusnya – satu perkara teknologi. Atas dasar setiap ahli perpustakaan ini, kami membuat riboswitch dan "menjahit" kepada sesetengah pihakgen menonjol (dalam kajian ini menggunakan gen cheZbertanggungjawab untuk motilitas sel E. coli dan terlibat dalam proses chemotaxis dalam bakteria ini). Transform kekurangannya cheZ (iaitu, tanpa gen ini dan tidak dapat bergerak) sel-sel Escherichia coli menggunakan perpustakaan yang diperoleh riboswitches dan menyebarkannya ke atas alam sekitar tanpa atrazin. Sekiranya riboswitch berfungsi, maka jika tidak ada atrazine, sel-sel tidak boleh bergerak; oleh itu, semua klon bakteria, kita hanya memilih yang tidak bergerak. Selepas dua pusingan pemilihan ini, peringkat kedua bermula – klon terpilih bertaburan pada hari Rabu dengan atrazine. Sekarang, tanda riboswitch yang bekerja, sebaliknya, telah menjadi mobiliti sel.

Skim penerimaan riboswitch. a – menggunakan teknik ini Selex kami membuat perpustakaan aptamers dengan pertalian purata untuk ligan dari urutan RNA rawak dan "menjahit" gen kepada masing-masing cheZ. b – kita mengubah kekurangannya cheZ bakteria menggunakan perpustakaan yang dihasilkan. Pilih tidak bergerak koloni sel pada medium tanpa atrazine dan bergerak pada medium dengan atrazine. Imej dari artikel dalam perbincangan Biologi Kimia Alam

Akibatnya, kita mendapat sejumlah riboswitches. Orang mesti memilih yang berfungsi paling baik. Untuk ini, mari kita "menjahit" setiap satu kepada gen demonstrasi khas lacZ. Gen ini terdiri daripada dua bahagian – wilayah transposase dan pengekodan urutan beta-galactosidase (untuk maklumat lanjut mengenai transposase, lihat: Tanaman meminjam gen dari "parasit genomik", "Elemen", 11/26/2007). Dan kemudian – semata-mata: semakin kuat tahap beta-galactosidase di hadapan atrazine, semakin baik riboswitch bekerja di dalam sel.

Setelah memilih yang terbaik dari semua riboswitches, para penyelidik memutuskan untuk memikirkan bagaimana ia berfungsi. Dalam satu siri percubaan elegan, mereka dapat menunjukkan bahawa aktiviti riboswitch berkaitan dengan terjemahan, dan bukan untuk transkripsi. Di samping itu, kami berjaya membuat model kerja riboswitch. Pada mulanya, apabila tidak ada atrazine, tapak pengikat ribosom disekat oleh tapak mengikat atrazine. Walau bagaimanapun, di hadapan atrazine, tapak ini dikeluarkan, RNA "duduk" pada ribosom, dan sintesis protein bermula.

Setelah mengetahui bagaimana riboswitch berfungsi, saintis meneruskan ke peringkat kedua kerja – mereka perlu mencari enzim yang memecahkan atrazine. Tiada masalah.Herbisida ini telah mencemarkan alam sekitar selama enam puluh tahun sekarang, dan banyak mikroorganisma telah belajar untuk memusnahkannya. Untuk kerja ini, penyelidik menggunakan salah satu daripada gen yang terkenal – AtzA, yang mengkodekan chlorohydrolase yang menukarkan atrazin kepada hydroxyatrazine. Tidak seperti atrazine, hydroxyatrazine adalah bahan yang agak aman. Ini bukan herbisida, dan ia dianggap tidak membahayakan kesihatan manusia. Di samping itu, atrazina lebih baik diserap di atas tanah. Oleh itu, penukaran atrazine kepada hydroxyatrazine mungkin berguna untuk memulihkan tanah yang dijangkiti.

Kini ia tetap hanya untuk mewujudkan sel-sel "sihir" E. coli, yang boleh menemui dan mengurai atrazine. Para saintis memodelkannya sedemikian rupa sehingga gen itu Chez (yang bertanggungjawab untuk pergerakan dan chemotaxis) dikawal oleh riboswitch, dan oleh itu, ia berfungsi hanya dengan kehadiran atrazine. Pada masa yang sama, gen AtzA (pemisahan atrazin) dan gen untuk protein fluoresen hijau GFP (ia menjadikan sel-sel lebih kelihatan dan juga memungkinkan untuk membezakan sel-sel mutan daripada yang biasa) sentiasa dinyatakan.

Untuk menguji bagaimana bakteria berfungsi, penyelidik menyebarkannya ke medium agar-agar yang mengandungi atrazin. Medium ini telah disediakan sedemikian rupa sehingga penguraian atrazine di atasnya membentuk bintik-bintik tertentu yang jelas.

Selepas pengeraman semalaman, koloni bulat dibentuk pada permukaan medium, yang terdiri daripada cincin cahaya dan cincin gelap. Menyiasat pendarfluor GFP, saintis mendapati bahawa cincin cerah terbentuk oleh sebilangan besar sel, manakala di kawasan gelap sel-sel itu jauh lebih kecil, dan juga, dilihat oleh bintik-bintik di permukaan medium, kurang atrazine.

Dianggap bahawa cincin ini muncul seperti berikut. Sekali dalam lingkungan yang kaya dengan atrazine, sel merangkak ke arah yang berbeza pada kadar yang berkadar dengan kepekatannya. Dibentuk koloni bulat. Terdapat banyak sel di dalamnya – ini bermakna mereka dengan cepat berjaya menguraikan atrazine, dan mereka tidak mempunyai apa-apa. Kemudian yang paling "cerdik" sel-sel ini dapat merangkak lebih jauh (akibat daripada peningkatan diameter titik) dan mencari "atrazine grounds" yang baru untuk diri mereka sendiri. Sel yang selebihnya, sekali dalam medium bebas beatrazin, kehilangan keinginan untuk bergerak, kerana dalam ketiadaan atrazine, pseudotaxis juga hilang dari mereka.Ini adalah bagaimana kawasan terang dan gelap muncul di tanah jajahan. Selepas beberapa ketika, atrazine berakhir di cincin luar; maka sel-selnya bermigrasi lagi, dengan hasilnya cincin baru muncul.

Lebih-lebih lagi, perlu diperhatikan bahawa bakteria kawalan kekurangan gen AtzA (iaitu, mampu merayap ke arah atrazine, tetapi tidak mampu menguraikannya), membentuk hanya koloni bulat tanpa penggantian kawasan cahaya dan gelap dan tanpa sebarang tempat, menunjukkan katabolisme herbisida.

Koloni sel pada medium yang mengandungi atrazine, menyala putih (di sebelah kiri) dan ultraviolet (di sebelah kanan) cahaya. Di atas (a) – koloni sel kawalan yang mengandungi Chez dikawal oleh riboswitch tetapi tanpa AtzA (iaitu, mereka yang dapat mencari atrazine, tetapi tidak mampu menguraikannya). Turun di bawah (b) – koloni sel yang mengandungi dan Chez dan AtzA (iaitu, mereka yang dapat mencari dan menguraikan atrazine). Ia dilihat bahawa sel-sel kawalan tidak mempunyai selingan cincin sepusat dan gelap di dalam tanah jajahan. Imej dari artikel dalam perbincangan Biologi Kimia Alam

Semua ini menunjukkan bahawa eksperimen itu berjaya, dan E. coli dapat mencari dan memusnahkan atrazine – yang bermaksud bahawa terdapat peluang yang besar untuk memerangi pencemaran alam sekitar,jadi untuk perkembangan biologi sintetik secara umum.

Sudah tentu, banyak isu belum dapat diselesaikan. Sebagai contoh, sel-sel E. coli "tidak melihat" atrazine dalam kepekatan yang rendah, dan oleh itu hanya boleh digunakan di tempat-tempat yang sangat tercemar. Tetapi kerja ini hanya permulaan, dan dalam eksperimen berikutnya, mungkin akan sama ada "skru" sel-sel. E. Coli ke keadaan yang lebih "atrazinochutkogo", atau menggunakan jenis bakteria yang berlainan. Ia juga sangat mungkin bahawa ia akan berguna untuk "mematikan" mobiliti sel-sel yang tidak ketiadaan, tetapi, sebaliknya, di hadapan atrazine – maka mereka akan membentuk tanah jajahan di tempat-tempat pengumpulannya, tetapi jika mereka menanggulanginya, mereka akan merangkak jauh dari perniagaan mereka.

Sumber: Joy Sinha, Samuel J. Reyes, Justin P. Gallivan. Pembiakan semula bakteria. // Biologi Kimia Alam (2010). V. 6. P. 464-470. Doi: 10.1038 / nchembio.369.

Vera Bashmakova


Like this post? Please share to your friends:
Tinggalkan Balasan

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: