RNA katalitik: ubat dari kehidupan prebiologi

RNA katalitik: ubat dari kehidupan prebiologi

Sydney Altman
"Tangan Pertama Sains" № 3/4 (57/58), 2014

Idea asas konsep dunia RNA, yang muncul pada tahun 1960-an, adalah mudah: pada peringkat awal evolusi prebiologi, objek yang mampu mengalikan dan bersaing untuk sumber terhad adalah molekul RNA yang berasingan, dan kemudian protein dan DNA menjadi tambahan, walaupun dan sangat penting, kepada aliran umum maklumat genetik. Konsep ini, yang pada awalnya bersempadan dengan fiksyen sains, kini telah kukuh dalam biologi dunia.

Penemuan yang paling penting adalah penemuan sifat katalitik RNA yang dibuat di makmal Professor S. Altman dari Universiti Yale (USA) dalam kajian enzim RNAse P (kini pemangkin enzim ini dipanggil ribozymes). Untuk penemuan sifat pemangkin RNA, Altman, bersama dengan T. Cech, menerima Hadiah Nobel dalam Kimia (1989). Penjelasan tentang sifat RNase P menjadi titik permulaan untuk mengubahnya menjadi alat untuk memusnahkan RNA yang tidak diingini, sebagai contoh, bakteria. Strategi rawatan sedemikian menjanjikan umat manusia sebagai kemenangan dalam perlumbaan, yang masih dianggap hilang, antara ubat-ubatan baru dan penentangan terhadap mereka, yang mana bakteria diperoleh.

Mengenai pengarang

Sydney Altman – Guru Profesor Biologi Molekul dan Selular dan Biologi Pembangunan di Universiti Yale, Profesor Kimia di Universiti Yale (Amerika Syarikat), Ketua Kimia Biologi Kimia Biologi Rusia-Amerika Institut Biologi Kimia dan Perubatan Asas Cawangan Siberia dari Akademi Sains Rusia (Novosibirsk). Pemenang Hadiah Nobel dalam Kimia (1989), diperoleh bersama dengan T. Cech "untuk penemuan sifat pemangkin RNA".

Hari ini, kita boleh melihat peninggalan yang telah terselamat daripada zaman misteri evolusi prebiologi – molekul RNA, yang tidak terlibat dalam pemindahan maklumat genetik biasa dari DNA ke protein, tetapi dalam perkara yang sama sekali berbeza yang penting untuk aktiviti penting tubuh. Kewujudan banyak regulator, pemangkin, penyesuai dan RNA struktural menunjukkan bagaimana kehidupan terawal, namun prebiologi sekali dapat dianjurkan.

Salah satu daripada peninggalan sejak empat puluh tahun yang lepas telah hilang dari rasa ingin tahu biokimia yang eksotik kepada kemungkinan "panacea" untuk semua penyakit. Kisah ini menunjukkan bagaimana, seolah-olah, dalam penyelidikan yang sangat penting idea baru tiba-tiba dilahirkan,berpotensi dapat mengubah kawasan aktiviti manusia yang paling penting – perubatan. Dalam kes kita, objek ini RNAse P – enzim yang terlibat dalam pasca transkripasi (iaitu, selepas membaca dari DNA) pengubahsuaian RNA.

Mengenai RNA "untuk patung-patung"

Selaras dengan dogma pusat biologi molekular, "teks" maklumat keturunan, yang ditulis dalam huruf nukleotida RNA (sebagai contoh, … AAAUUGAGAUC …), diterjemahkan ke dalam teks lain yang ditulis dalam surat asid amino semasa siaran. Terjemahannya, iaitu, sintesis protein pada matriks RNA pengekodan, dilakukan oleh ribosom – mesin pengeluaran protein makromolekul sel khusus. Fungsi ribosom adalah mustahil tanpa dua kelas RNA yang sudah tidak dikodekan: ribosom RNA (rRNA) dan pengangkutan RNA (tRNA).

E. coli ribosomes (bakteria Escherichia coli), kerja biologi molekul, mengandungi tiga molekul rRNA yang berbeza, dan kami mempunyai empat. Jadi kehidupan itu tidak kelihatan seperti madu kepada ahli biologi, masing-masing rRNA ini E. coli dikodkan oleh tujuh gen yang berbeza yang sangat serupa antara satu sama lain; keadaan pada manusia adalah sama.

Tetapi jika anda melihat tRNA,di sini ia masih lebih rumit: E. coli mempunyai 86 gen pengekodan tRNA untuk 20 asid amino standard, tetapi seorang lelaki dengan 497 nuklear dan 22 mitokondria RNA pengangkutan jauh di belakang. Sudah tentu, sejumlah tRNA yang berbeza adalah lebih daripada cukup untuk mengekod 20 asid amino atau bahkan 61 triplet-anticodon. Beberapa perbezaan antara molekul tRNA yang mengandungi triplet yang sama diketahui mempunyai makna fungsional, dan sel menggunakan beberapa jenis tRNA tertentu, bergantung kepada keadaan.

Struktur tRNA sering digambarkan sebagai "daun semanggi." Sebenarnya, sangat mengejutkan bahawa rantai yang agak pendek (kebanyakan tRNA adalah 75 hingga 95 nukleotida panjang) boleh melipat ke dalam struktur yang mengandungi empat cabang, "batang" dan tiga gelung. Di salah satu gelung terletak antikodon – rantau tiga-nukleotida yang mengiktiraf codon pengekodan asid amino tertentu dalam RNA messenger.

Sebagai tambahan kepada gelung utama, tRNA juga mengandungi gelung pembolehubah yang dipanggil, panjang yang berfungsi sebagai ciri utama mengikut mana tRNA dibahagikan kepada dua kumpulan: untuk kelas I tRNA, ia adalah pendek (3-5 nukleotida), dan untuk kelas II ia boleh lebih lama daripada gelung utama.Tangkai akseptor mengandungi rantau yang terkandas pendek pada 3'akhir (selalunya 4 nukleotida panjang), berakhir dengan urutan … CCA, yang mampu melampirkan asid amino untuk membentuk aminoacyl-tRNA, blok bangunan utama sintesis protein.

Tetapi gambar yang biasa dengan daun semanggi hanyalah gambarajah: struktur spatial tRNA benar benar berbeza dan kemungkinan besar menyerupai huruf "G" dengan dimensi ~ 6 × 6 nm, di mana anticodon dan 3'-akhir dari batang penerima diterima jarak jauh. .

Ribozyme "tidak dapat dibaca"

Biasanya, tRNA disintesis sebagai molekul prekursor yang panjang (contohnya, dalam bakteria, beberapa gen bersebelahan biasanya "dibaca" bersama oleh satu molekul RNA). Oleh itu, semasa pematangannya, tRNA dipotong daripada transkrip lagi. Proses ini dilakukan oleh enzim RNase E, tetapi pada masa yang sama, pada 5'- dan 3'-hujung tRNA prekursor, beberapa nukleotida tambahan kekal, dan tindakan nukleus spesifik lain diperlukan untuk penyingkirannya.

Salah satu enzim ini, RNase P, direka untuk membuang nukleotida dari 5 'akhir tRNA prekursor.Gangguan ini menjadi tumpuan utama dalam makmal saya sejak awal 1970-an, apabila kami mendapati bahawa tRNA disintesis daripada RNA prekursornya. Tetapi, tentu saja, penemuan yang paling penting dan tidak dijangkakan mengenai silakan ini, diterbitkan pada tahun 1983 dalam jurnal Sel, adalah untuk mengesan sifat pemangkin RNA konstituennya. Dalam erti kata lain, enzim itu bukan protein, tetapi RNA – kini pemangkin sebegini dipanggil ribozim.

Enzim RNase P dalam semua organisma hidup terdapat dalam kompleks dengan sekurang-kurangnya satu protein. Sebagai tambahan kepada RNA pemangkin, enzim bakteria mengandungi hanya satu protein (RnpA). Oleh: (Walker Engelke, 2008)

Malah, RNA dalam RNase P tidak berfungsi sendiri. Ia boleh memangkin tindak balas dalam vitro, tetapi dalam semua organisma hidup ia bersamaan dengan sekurang-kurangnya satu protein, dan dalam organisma yang lebih tinggi (eukariota) bilangan yang terakhir mencapai sepuluh. Walaupun RNA, walaupun membuang protein, mengekalkan aktiviti pemangkin sebahagiannya, ia tidak dapat berfungsi dalam sel tanpa satu komponen protein RNase P. Walau bagaimanapun, adalah logik untuk mengandaikan bahawa semua RNases P yang diketahui hari ini berasal dari prekursor yang mengandungi hanya RNA,bila "leluhur" ini wujud: pada masa-masa evolusi awal "dunia RNA" atau kemudian, apabila saluran paip sintesis protein mula memperoleh pandangan moden.

Kajian kami tentang mekanisme tindakan RNase P membolehkan kami menubuhkan keperluan minimum untuk substratnya. Apa yang harus dilihat oleh molekul RNA supaya ia dapat dikenali dan dipotong oleh ribozyme ini?

Hebatnya, struktur daun semanggi tidak diperlukan untuk semua ini. RNase P cekap memotong mana-mana RNA yang menyerupai batang tRNA, iaitu sebahagiannya dua kali ganda dengan satu-stranded 3'-end yang bebas … RCCA (di mana R ialah adenina atau guanine residue). RNase P memecahkan substrat ini dari terminal 5'-di titik di mana DNA double-strand berakhir dan "ekor" terdampar tunggal bermula. Walaupun kita mengambil sasaran satu RNA dengan urutan apa pun, dan yang lain – pelengkapnya – untuk membekalkannya dengan ekor RCCA (apa yang dipanggil urutan panduan luar), maka sasarannya masih akan berpecah.

Enzim RNase P terlibat dalam penghapusan nukleotida dari 5'akhir tRNA prekursor, terletak di sebelah 3 '- ekor. Walau bagaimanapun, ternyata kerja itu tidak memerlukan struktur "daun semanggi", di mana tRNA biasanya diwakili.RNase P berkesan memecahkan mana-mana RNA yang menyerupai "batang" tRNA, iaitu, sebahagiannya dua daratan, dengan hujung tunggal 3-stranded percuma. Enzim itu memecahkan substrat ini dari bahagian 5'di tempat di mana DNA double-strand berakhir dan ekor terdirus tunggal bermula

Sebab-sebab "tidak sah" seperti itu jelas mengikuti struktur RNase P, yang diterangkan oleh analisis sinar-X. Ribozyme mengikat substrat terutamanya disebabkan oleh pematuhan strukturnya kepada bentuk substrat, dan ikatan pelengkap khusus hanya terbentuk di rantau 3'-akhir, di mana ekor yang tidak dapat dilalui terletak. Lebih-lebih lagi, ada kemungkinan untuk menggunakan walaupun RNA panduan yang diubahsuai secara kimia, jika hanya mengandungi urutan yang diperlukan untuk pengiktirafan.

Dalam archaea – prokariot uniselular, yang dalam beberapa gen dan laluan metabolik lebih dekat dengan eukariot daripada bakteria – untuk pembentukan RNase P, RNA mengikat protein 4-5, tidak ada yang serupa dengan RnpA. Dalam eukariota, sehingga sepuluh protein dikaitkan dengan RNA pemangkin, sebahagiannya adalah homolog pada protein arkeologi, sementara yang lain adalah unik untuk eukariota. Oleh: (Walker Engelke, 2008)

Terhadap rintangan dadah

Penjelasan mengenai kekhususan substrat RNase P adalah titik permulaan untuk carian lanjut. Oleh kerana kita boleh memecahkan hampir mana-mana RNA menggunakan RNase P, mengapa tidak mengubahnya menjadi alat untuk menghancurkan RNA yang tidak diingini? Sebagai contoh, jika kita boleh memperkenalkan RNA panduan luaran ke sel-sel bakteria patogen, RNase P mereka sendiri akan memusnahkan sasaran RNA selular pelengkap, kehilangan yang akan membunuh bakteria.

Adakah ini diperlukan? Penggunaan antibiotik yang tidak terkawal secara meluas telah menyebabkan peningkatan dalam mikroba tahan dadah. Salah satu sebab utama penampilannya adalah bahawa bakteria mudah menukar potongan bahan genetik (plasmid), yang sering membawa gen rintangan antibiotik. Jadi jika plasmid seperti itu muncul dalam populasi bakteria atau bahkan dalam ekosistem mikroba yang terdiri daripada spesies yang berlainan, maka tidak lama lagi semua anggotanya akan menjadi pembawa jika antibiotik yang sesuai hadir di alam sekitar. Semua sel bakteria yang lain hanya akan pupus.

Ia perlu untuk menjelaskan bahawa rintangan dadah boleh berkembang dengan sebab lain yang berkaitan dengan mutasi protein sasaran dalam ubat, pengeluaran protein sasaran terlalu banyak oleh sel, serta pengaktifan gen-gen yang bertanggungjawab untuk mengeluarkan dadah dari tubuh. Secara umumnya, skala masalah rintangan dadah dan risiko yang berkaitan dengannya sangat besar. Contohnya, bentuk tuberkulosis yang tahan multidrug, tidak sensitif kepada antibiotik anti-TB anti-TB (isoniazid dan rifampicin) dan bertanggungjawab ke atas 4% kes baru dan 20% kambuhan penyakit diperhatikan di seluruh dunia pada hari ini. Jika bakteria tuberkulosis juga telah menimbulkan ketahanan terhadap antibiotik quinolone dan ubat barisan kedua – kanamisin, dan lain-lain, maka ia menyebabkan penyakit dengan rintangan dadah yang melampau. Dan kes-kes sedemikian di dunia puluhan ribu setiap tahun. Tambahnya di India, Iran dan Itali, sudah ada kes-kes tuberkulosis dengan jumlah rintangan dadah, yang secara prinsipnya tidak diterima oleh antibiotik moden.

Keadaan ini tidak membaik dan fakta itubahawa pembangunan antibiotik baru bernilai berjuta-juta dolar, dan syarikat-syarikat farmaseutikal tidak beratur untuk menghabiskan berjuta-juta ini pada penciptaan ubat murah untuk sekelompok pengguna yang sempit. Pesakit yang, tanpa teragak-agak, akan menghabiskan puluhan ribu dolar untuk menjalani kemoterapi untuk kanser, memanjangkan jangka hayat selama beberapa bulan, enggan membayar seratus dolar untuk rawatan jangkitan.

Hit tepat

Menyedari potensi terapeutik urutan panduan luaran RNase P, kami mula mencari jalan untuk memberikannya secara efisien ke sel-sel bakteria. Untuk tujuan ini, urutan panduan disambungkan dengan peptida khas (serpihan protein pendek), yang boleh membuat lubang di dinding sel bakteria atau diangkut secara aktif ke dalam sel. Urutan panduan dalam kes ini memainkan peranan sejenis "penumpang".

Satu lagi keputusan penting ialah pilihan sifat kimia urutan panduan: kita tidak menggunakan RNA biasa atau DNA, tetapi apa yang dipanggil morpholino oligonucleotidesdi mana sebaliknya residu karbohidrat ribose atau deoxyribose terdapat kumpulan heterocyclic morpholino.Pembinaannya lebih stabil dalam sel dan membentuk kompleks yang lebih ketat dengan sasaran RNA.

Sebagai sasaran, kami menggunakan mRNA bakteria yang ditranskripsikan dari gen gyrA, yang mengkodekan enzim gyrase DNA yang diperlukan untuk replikasi bakteria. Inaktivasi DNA gyrase adalah maut kepada sel-sel bakteria. Oleh itu, gyrase adalah sasaran yang diketahui untuk kumpulan antibiotik penting seperti fluoroquinolones (contohnya, ciprofloxacin antibiotik yang baru-baru ini) dan aminocoumarins.

Gen gyrA begitu konservatif sehingga menjadi mungkin untuk membuat urutan panduan yang biasa kepada beberapa patogen. Di makmal kami, sifat-sifat bakterisida urutan panduan telah disiasat ke atas beberapa jenis bakteria, yang sama ada patogen atau model bakteria berbahaya. Dalam kebanyakan kes, apabila menggunakan ubat kita, kurang daripada 1% bakteria terselamat, walaupun harus diakui bahawa kepekatan dadah itu agak tinggi berbanding dengan kepekatan kerja antibiotik biasa.

Diilhamkan oleh kejayaan pertama, kami memberi perhatian kepada penyakit lain – malaria. Salah satu agen penyebab malaria, Plasmodium falciparum, tidak merujuk kepada bakteria, tetapi kepada eukaryotes unisel. Walau bagaimanapun, dalam pengasingan klinikal parasit ini, rintangan terhadap banyak ubat antimalarial juga diperhatikan. Apabila kita membangunkan urutan panduan untuk pembelahan sasaran pengekodan mRNA gyrase plasmodium DNA dan memperkenalkannya ke sel darah merah yang dijangkiti, parasit berhenti berkembang. Walau bagaimanapun, terasa hebat jika kita memperkenalkan urutan panduan yang dibangunkan untuk gen gyrA bakteria, iaitu dalam kes ini, sasaran mRNA secara khusus dimusnahkan P. falciparum.

Ramai ubat-ubatan dengan nasib malang mengakhiri kerjaya mereka pada masa yang sama, walaupun menjanjikan keputusan awal, mereka tidak menunjukkan aktiviti dalam organisma hidup. Oleh itu, pada peringkat seterusnya, kami mencuba pendekatan kami dalam situasi yang lebih dekat dengan realiti – pada luka purulen.

Sudah tentu, demi sains, bukanlah orang yang menderita, tetapi tikus makmal, yang disuntik di belakang, dan mereka membuat penggantungan Staphylococcus aureus, agen penyebab kulit manusia yang kerap berlaku, dalam luka yang dihasilkan. Keesokan harinya, luka itu ditutup dengan gel khas,yang mengandungi oligonucleotide morpholino yang diarahkan kepada mRNA dari gyr gen bakterya, yang sebelum ini telah terbukti sangat sensitif terhadap dan tahan terhadap strain antibiotik; kawalannya sama ada urutan yang tidak spesifik atau saline normal. Ternyata luka sembuh dengan cepat lebih cepat pada tikus yang dirawat dengan oligonukleotida morpholino aktif, berbanding dengan kumpulan kawalan. Menurut data mikroskopi, rawatan itu membawa kepada pertumbuhan semula epitel yang lebih baik dan lapisan kolagen yang matang. Selain itu, dalam luka tikus tersebut, jumlah bakteria juga lebih kecil. Oleh itu, ujian aktiviti yang ketat dalam badan mamalia telah diluluskan – sekurang-kurangnya pada tikus.

Strategi rawatan berdasarkan tindakan RNase P ribozyme menjanjikan umat manusia kemenangan dalam perlumbaan yang sehingga kini dianggap hilang: antara ubat-ubatan baru dan penentangan terhadap mereka, yang mana bakteria diperoleh. Lagipun, apabila pembangunan ubat baru bernilai $ 100 juta, dan mengambil masa 10 tahun untuk mendapatkan dari idea itu ke rak farmasi, dan bakteria menjadi tahan sepenuhnya dalam satu atau dua tahun, maka tidak ada sebab untuk meneka tentang pemenang.

Dadah yang boleh merosakkan RNA bakteria secara drastik boleh mengubah keadaan ini dengan drastik. Setelah mengesahkan keselamatan dan keberkesanan kumpulan sebatian ini, sebagai contoh, morpholine oligonucleotides yang disambungkan kepada peptida tertentu yang mampu memasuki sel, urutan panduan boleh diubah dengan bebas dengan mensasarkannya pada pelbagai gen patogen yang penting. Atau menggabungkan sasaran, menjadikan kemunculan rintangan dadah hampir mustahil. Akhirnya, dan untuk farmakologi, ini agak terkecuali daripada peraturan – jenis ubat yang sama boleh bertindak terhadap bakteria, protozoa dan kulat, mungkin juga virus dan jenis sel kanser tertentu. Untuk melakukan ini, cari jalan untuk menyampaikan ubat di tempat yang betul.

Mengapakah doktor masih bergantung kepada ampicillin, chloroquine dan senjata lain bertahun-tahun yang lalu untuk rawatan jangkitan? Jawapannya terletak terutamanya dalam bidang ekonomi. Morfoline (dan mana-mana yang lain) menyasarkan urutan yang lebih mahal daripada antibiotik tradisional, yang telah dihasilkan secara besar-besaran,dan syarikat farmaseutikal takut bahawa pesakit dan doktor akan memilih untuk terus menggunakan ubat-ubatan lama. Walau bagaimanapun, perbezaan harga tidak begitu besar: satu dos boleh menelan kos sebanyak 2-3 dolar lebih daripada satu dos antibiotik biasa. Terapi berdasarkan urutan penargetan RNase P adalah berkesan dan mempunyai kesan sampingan yang lebih sedikit. Pada pendapat kami, masa telah datang untuk menyatukan usaha saintis, doktor, syarikat farmaseutikal dan negeri dan melabur dalam teknologi baru yang akan membawa manfaat yang luar biasa kepada semua.

Pengarang mengucapkan terima kasih kepada Prof., D. B. n D. Zharkova (ICBFM SB RAS, Novosibirsk) untuk menyediakan penerbitan berdasarkan kuliah yang diberikan oleh penulis pada bulan Mei 2014 di Novosibirsk. Kerja ini disokong oleh geran dari Kerajaan Persekutuan Rusia (2013).

Sastera
1. Vlasov V. V., Vorobyev P. E. Dunia RNA: Semalam dan Hari Ini // Sains Pertama. 2012. № 3 (45). Ms 40-49.
2. Gorman K., Fayn Maron D. Revolusi dalam dunia RNA // Di dunia sains. 2014. No. 6. P. 70-77.
3. Grigorovich S. Pada mulanya RNA? Dalam Mencari Molekul Pertama-Hidup // Sains dan Kehidupan. 2004. № 2.


Like this post? Please share to your friends:
Tinggalkan Balasan

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: