Hasil kajian dekade pertama CRISPR diringkaskan • Elena Naimark • Berita sains mengenai "Unsur" • Biologi molekular, Mikrobiologi, Genetik

Keputusan dekad pertama kajian CRISPR

Rajah. 1. Bacterium Streptococcus thermophilus, dengan asasnya kewujudan kekebalan prokariot yang diperoleh telah dibuktikan untuk pertama kalinya dan mekanismenya dibongkar. Foto dari mysticalbiotech.com

10 tahun yang lalu, sebuah artikel diterbitkan oleh Danisco, kumpulan penyelidikan perusahaan makanan Danisco, di mana kehadiran imunitas yang diperoleh di prokariota terbukti dan karyanya berdasarkan transkrip CRISPR ditunjukkan. Dalam dekad ini, imuniti bakteria dan arkea yang diperolehi dari kategori fenomena eksotik di dunia mikrob telah diluluskan ke dalam kategori sifat-sifatnya. Kajian telah menunjukkan bagaimana ia dapat dibentuk dalam perjalanan evolusi, apakah kepelbagaian alat molekul dalam kekebalan CRISPR dan, yang paling penting, bagaimana ia dapat digunakan. Potensi penggunaan mikrobiologi dan terapeutik instrumen molekul CRISPR sangat besar, walaupun kerja baru-baru ini menunjukkan bahawa mereka perlu diperbaiki untuk tujuan klinikal.

10 tahun yang lalu Rodolphe Barrangou dan Philippe Horvath dan rekannya mendapati CRISPR dalam prokariota dikaitkan dengan pengambilalihan imuniti (lihat R. Barrangou et al, 2007. CRISPR Menyediakan Rintangan yang Dibeli Terhadap Virus dalam Prokariota). 10 tahun adalah masa yang sangat singkat untuk sains, tetapi masa yang agak besar untuk prinsip revolusioner yang ribut.Pada kesempatan tarikh bulat, Barranga dan Horvath, yang melancarkan revolusi ini, diterbitkan dalam jurnal Mikrobilogi alam mengkaji sejarah penyelidikan CRISPR.

Ingat bahawa sistem CRISPR adalah satu siri ulangan palindromik, di antaranya adalah segmen pendek DNA virus – yang dipanggil spacer. Sistem ini juga mesti termasuk cas-gens (cas bermaksud CRISPR yang berkaitan – "dikaitkan dengan CRISPR"). Keseluruhan sistem ini direka untuk mengenal pasti urutan nukleotida asing dan untuk memperbaikinya. Selepas itu, gunting nukleus (endonukleases memasuki Cas, atau cara lain, misalnya, RNases) masuk untuk memotong DNA virus. Musuh demikian tidak berbahaya. Tetapi ini tidak mencukupi: untuk bakteria yang telah terselamat serangan virus, segmen palindromik baru dengan spacer virus ditambah pada permulaan kaset (lihat kaset Gene). Sekarang sekeping DNA musuh yang dikalahkan dimasukkan ke dalam genom bakteria dan akan dipindahkan ke keturunan bakteria. Begitulah imuniti yang diperolehi di dalam bakteria dan archaea. Ia sentiasa dikemas kini sebagai sel bakteria menghadapi jangkitan virus.

Pada akhir 1980-an, laporan pertama kehadiran dalam genom bakteria (E. coli, tubercle bacillus,serta beberapa sianobakteria) dan arkib siri perulangan palindromik dengan sisipan pendek antara mereka. Apa jenis pengulangan dan mengapa mereka diperlukan adalah tidak jelas. Mereka dilihat sebagai penghalang dalam pemasangan serpihan genom. Pada tahun 1990-an, apabila genom bakteria mula disusun secara besar-besaran ("dibaca"), ternyata bahawa ulangan bukan unsur eksotik DNA bakteria dan archaea individu, tetapi komponen genom mereka yang sangat biasa.

Pada tahun 2002, pengulangan ini dinamakan CRISPR, yang, tidak seperti cadangan sebelumnya (repeat pembolehubah DVR – pengulangan langsung, TREP – tandem repeats, LTRR – urutan berulang yang berulang-ulang berulang, SRSR – pengulangan jarak biasa yang teratur, LCTR – , SPIDR – spacer diselingi pengulangan langsung), terjebak dalam sains. Tetapi fungsi ulang ini tetap tidak jelas, sehingga pada tahun 2005 karya-karya (pada masa yang sama tiga artikel dari kumpulan saintifik yang berbeza) keluar di mana ia dinyatakan bahawa spacers menyerupai serpihan jujukan virus atau plasmid. Dan tidak hanya apa-apa, tetapi yang dihadapi oleh populasi bakteria yang dipelajari. Oleh itu, seperti yang dicadangkan dalam artikel-artikel ini, kesan sistem CRISPR mungkin agak serupa dengan gangguan RNA (penindasan ekspresi gen pada tahap transkripsi, terjemahan atau penurunan mRNA), walaupun tidak ada analog instrumen interferensi RNA cas– tiada item.

Ini diikuti oleh kerja kumpulan saintifik syarikat makanan industri Danisco, yang, khususnya, terlibat dalam bakteria untuk pembuatan produk asid laktik. Mereka menggunakan jujukan CRISPR untuk membezakan antara bakteria bakteria Streptococcus thermophilus (Rajah 1), yang digunakan untuk pembuatan yogurt. (Sudah jelas bahawa CRISPR harus sangat spesifik untuk strain.) Apabila data CRISPR mencukupi, mereka tertakluk kepada analisis kluster. Dan tiba-tiba ternyata bahawa kluster yang terhasil daripada ulangan palindromik dikaitkan dengan penentangan terhadap pelbagai jangkitan virus! Dan, lebih penting lagi, spacer tambahan dengan segmen palindromik terdapat pada bakteria yang telah mengalami serangan virus. Pada awal 2000-an, strain-strain tahan terhadap phenylite sudah digunakan. Selepas membandingkan strain yang digunakan dalam industri pada tahun 1980-an-1990-an, dengan keturunan mereka yang tahan dari tahun 2000-an, ia menjadi jelas apa sebenarnya yang memberi tentangan kepada jangkitan. Teka-teki ini telah berkembang: speker CRISPR menentukan kekebalan bakteria bakteria selepas jangkitan.

Pasukan Danisco menguji andaian ini dalam satu siri eksperimen: strain telah dirawat dengan phages yang diketahui dan kemudian dipadankanurutan nukleotida genom mereka. Di samping itu, mereka cuba menghidupkan dan mematikan gen yang berlainan, termasuk cas. Dan ternyata bahawa, palindromes baru dengan spacer virus sedang ditambah ke kaset CRISPR dan itu casgen terlibat dalam pembentukan laman CRISPR baru. Mereka adalah (khususnya cas9) adalah perlu bagi pengiktirafan dan peneutralan agen-agen viral. Peserta utama imuniti yang diperoleh mengambil tahap – palindrom, spacer virus dan beberapa gen cas; menggariskan potret sistem CRISPR-Cas, yang memberikan kekebalan bakteria yang diperoleh (lihat R. Barrangou et al., 2007. CRISPR menyediakan kelulusan).

Perhatikan bahawa walaupun hipotesis mengenai perencatan DNA virus oleh jenis gangguan RNA telah dikemukakan pada tahun 2006 (lihat KS Makarova et al., 2006). , analogi fungsional dengan RNAi eukariotik, dan mekanisme hipotetis tindakan), kerja-kerja massa mengenai kajian fenomena ini bermula hanya selepas 2007 (Rajah 2). Adalah penting bukan hanya untuk mengemukakan hipotesis yang berkesan tetapi untuk membuktikan realiti fenomena itu dan menentukan "roda dan gearnya". Kemudian ada kemungkinan penyelidikan yang bermakna. Dan mereka tidak lambat mengikuti. Selain itu, rasa imuniti yang diperolehi mengejutkan dunia saintifik: warisan Lamarckian di duniaprokariot! bangsa senjata evolusi dalam bakteria dan phages! bakteria mempunyai mekanisme khas untuk perlindungan terhadap DNA asing dengan jenis gangguan dalam eukariota! Percuma!

Rajah. 2 Sejarah penyelidikan CRISPR dibahagikan kepada empat tempoh: "Antiquity" (1990-2000), "Zaman Pertengahan" (2000-2007), "Sejarah Baru" (2007-2013) dan masa kini. Kronologi kerja yang paling penting dalam bidang ini ditunjukkan (nombor – rujukan kepada karya-karya ini, sebagaimana yang diberikan dalam artikel asal oleh R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Satu dekad penemuan: fungsi dan aplikasi CRISPR

Tidak lama kemudian, mekanisme yang serupa telah ditemui. E. coli. Dan untuk Streptococcus thermophilus satu syarat tambahan terbuka untuk pengiktirafan urutan virus yang disasarkan: adalah perlu bahawa ia didahului oleh satu set khas nukleotida. Dia menerima nama PAM (motif bersebelahan protospacer, iaitu satu set nukleotida, berbaring di hadapan penjelajah proto). Dan fungsi Cas9 juga diturunkan: ia adalah endonuclease yang memotong DNA, berundur dengan tepat 3 nukleotida selepas protopacer. Dan kemudian ada laporan tentang keperluan lain untuk sistem pengenalan CRISPR dari urutan virus yang disasarkan, yang disebut tracrRNA (tracrRNA, trans-activated CRISPR RNA; lihat Imuniti yang diperolehi daripada bakteria boleh dikaitkan dengan mekanisme gangguan RNA, "Elements", 6 April 2011 ).TracrRNA adalah urutan 25 nukleotida, pelengkap kepada segmen palindromik dan terletak pada helai DNA bertentangan dari CRISPR. Itulah sebabnya dia mendapat awalan "trans" dalam nama itu.

Apabila RNA dibaca dari urutan CRISPR, pra-mRNA belum lama 511 nukleotida diperolehi. Ia mesti dipotong ke dalam "hak" kepingan spacer palindrom – yang disebut CRRNA (CRISPR RNA). Di sinilah tracrRNA dihidupkan, menyertai palindrome dan menghasilkan helai berganda pendek. Dalam bentuk ini, peserta sistem CRISPR boleh belajar mengenainya (Cs9, Сsn1, RNazIII). Penampilan di peringkat menengah pematangan satu helai dua RNA meningkatkan keserupaan dengan gangguan RNA: terdapat juga kompleks dua helai pelengkap RNA, yang Dicer dapat mengenali dan memotong sehelai panjang menjadi serpihan pendek 25 nukleotida.

Pada tahun-tahun berikutnya, saintis telah menunjukkan bagaimana pelbagai sistem CRISPR dalam prokariot. Dan seperti biasanya, selepas pengumpulan data mengenai kepelbagaian elemen konstituen, klasifikasi muncul. Sistem CRISPR kini dibahagikan kepada beberapa kelas, jenis, dan subtipe, yang memberi tumpuan kepada perbezaan unsur-unsur fungsional SAS dan sistem sasaran DNA pengenalan atau RNA.Walaupun prinsip kekebalan yang diperolehi adalah sama untuk semua prokariot – sistem ini dikodkan dalam DNA, bertujuan untuk mengenali bahagian DNA atau RNA asing menggunakan RNA dan memusnahkannya dengan endonukleases – terdapat banyak variasi.

Terdapat dua kelas CRISPR (Rajah 3): pertama, pengeluar utama (agen aktif) adalah kompleks Cascade (kompleks CRISPR untuk pertahanan antivirus) dan endonuclease Cas3, di kedua – Cascade tidak hadir, dan endonuclease Cas9 berfungsi. Dalam kedua-dua kelas, terdapat protein CAS1 dan CAS2, oleh itu mereka tidak terlibat dalam klasifikasi. Protein-protein ini, seperti yang ternyata, melengkapkan serpihan baru palindrom spacer ke permulaan kaset CRISPR.

Rajah. 3 Skim CRISPR-sistem dan klasifikasi mereka berdasarkan perbezaan dalam Cas dan molekul sasaran (DNA atau RNA). Imej dari R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Satu dekad penemuan: fungsi dan aplikasi CRISPR

Perbezaan antara endonukleases adalah asas untuk membezakan jenis dalam kelas. Tipe 1 adalah endonuclease Cas3, yang memotong salah satu helai DNA DNA. Jenis 2 ialah Cas9, yang memotong kedua-dua helai DNA. Jenis 3 – Cas10 (di tempat tertentu, memotong RNA sasaran). Jenis 4 – Csf1 (memusnahkan DNA berganda, tetapi belum diketahui bagaimana). Jenis 5 dicirikan oleh Cas12, yang membuat dua potongan dalam dua helai DNA.Jenis 6 – Cas13 ("runtuh" ​​RNA messenger tunggal terkandas). PAM mengambil bahagian dalam operasi sistem jenis 1, 2, 5, dan 6 (dalam Rajah 3 mereka ditunjukkan dengan asteris). Setiap 6 jenis ini mempunyai bahagiannya sendiri: kini terdapat 19 subtipe. Sekitar 90% arkea dan 40% bakteria dalam satu bentuk atau yang lain mempunyai perlindungan CRISPR terhadap phages dan unsur mudah alih asing.

Penyelidikan cas dibenarkan untuk membina semula kemungkinan evolusi sistem CRISPR. Dianggap bahawa mereka muncul sebagai turunan enzim yang tahu bagaimana untuk memotong dan menjahit elemen mudah alih ke urutan nukleotida. Ia didapati ketika mereka menganggap nenek moyang mungkin. cas1. Nenek moyang protein ini tidak dikaitkan dengan CRISPR, tetapi terlibat dalam memotong dan menampal transposon dengan tepat. Keluarga protein nenek moyang ini disebut casposone (lihat M. Krupovic et al., 2015). Casposons: superfamili baru yang mensintesis imuniti CRISPR-Cas baru). Adalah jelas bahawa maksud memotong dan menampal transposon adalah serupa dengan memotong dan menampal spacer baru. Oleh itu, set alat yang sama sesuai untuk kedua-dua tindakan – Cas1 dan derivatif yang diubahsuainya. Selain itu, caspozone mempunyai urutan berulang terminal yang boleh dengan mudah diubah dan menjadi pakar dalam palindrom CRISPR.

Perlindungan bakteria dan arkea yang kuat dalam bentuk kekebalan CRISPR yang diwariskan telah timbul akibat perlumbaan tuan rumah dan parasit. Bakteria membangunkan sistem perlindungan yang lebih canggih, dan virus mengembangkan cara-cara yang lebih canggih untuk mengelakkan perlindungan ini. Sangat sukar bagi virus untuk mengalahkan perlindungan CRISPR dalam populasi bakteria, kerana sel-sel bakteria yang berbeza membawa satu set spacer yang berbeza. Oleh itu, phage, walaupun telah mengubah urutan pada satu atau dua tapak sasaran (protopacers) dan mengatasi satu atau dua crRNAs, tidak dapat mengubah keseluruhan set laman protopacener secara serentak. Seperti yang telah ditunjukkan oleh kajian, jika populasi bakterinya sekurang-kurangnya agak pelbagai, maka serangan virus adalah kegagalan (lihat Para saintis telah mengetahui mengapa sukar bagi bakteria untuk melawan sistem imun bakteria, Elemen, 18 April 2016). Oleh itu, perlumbaan senjata telah membawa kepada hakikat bahawa virus telah mengambil jalan yang berbeza, "cuba" untuk menganjurkan sistem penolakan anti-CRISPR bersama. Ia melibatkan sintesis protein kecil (urutannya dikodkan dalam DNA virus), yang menghalangi protein Cas, termasuk Cas9 (lihat A. Pawluk et al., 2016. Secara semulajadi berlaku bagi Beralih kepada CRISPR-Cas9).Dari sudut pandang virus, ini adalah penyelesaian yang sangat membina.

Pada tahun 2011, kerja telah diterbitkan yang mengesahkan kemungkinan pemindahan CRISPR dari satu bakteria kepada yang lain (lihat R.Sapranauskas et al., 2011. Streptococcus thermophilus Sistem CRISPR / Cas menyediakan imuniti dalam Escherichia coli). Ini membuka kemungkinan besar untuk menggunakan sistem CRISPR-Cas. Di sinilah idea pengeditan genom bermula dengan bantuan toolkit ini. Lagipun, jika anda berfikir tentang gunting molekul, yang secara bebas dapat mencari tempat yang dikandung oleh penyelidik dan memotong dengan tepat di mana diperlukan. Untuk melakukan ini, anda perlu melampirkan gunting nukleus ke urutan RNA dengan spacer dan palindrome, yang akan dipotong di mana penyelidik dimaksudkan – dari kedua-dua hujung serpihan sasaran atau dari satu. Dan untuk apa yang digunakan gunting ini – banyak pilihan yang hebat. Berikut adalah sebahagian daripada mereka.

Kaedah genotip klon bakteria dan konsortia di sepanjang satu set spacer unik telah meningkat dengan ketara. Ini memulakan penggunaan CRISPR dalam industri makanan. Sekarang, tidak mungkin hanya untuk memilih ketegangan yang dikehendaki oleh urutan spacer, tetapi juga untuk menentukan urutan mesyuaratnya dengan ejen phage, kerana urutan speker CRISPR mencerminkan sejarah pertemuan-pertemuan ini (Gambar 4).

Rajah. 4 Kelompok seperti itu boleh didapati dengan mengkaji urutan CRISPR dalam pelbagai strain: strain dengan kaset yang sama dikelompokkan bersama (cluster 1); dalam kumpulan yang lain akan ada strain dengan spacer tambahan yang dimasukkan pada awal kaset (mereka menandakan serangan baru-baru ini oleh virus dalam strain anak perempuan) (cluster 2); akan ada kumpulan dengan set spacer yang unik yang akan menunjuk kepada sejarah yang berasingan dari strain di bawah kajian (kelompok 3, 4, 5). Imej dari R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Satu dekad penemuan: fungsi dan aplikasi CRISPR

Anda boleh membuat perubahan atau meningkatkan rintangan strain bakteria kepada pelbagai phages. Kestabilan dalam kes ini bermakna pengiktirafan yang tepat terhadap musuh dan penetapannya (ada cara lain untuk mewujudkan kestabilan – sebagai contoh, meletakkan halangan untuk mendapatkan musuh di dalam sel). Untuk menghasilkan ketegangan yang tahan, perlu diperkenalkan sistem RNA / DNA yang disintesis ke sel-sel.cas. Selanjutnya, bakteria itu pasti akan membenamkan sekeping virus ke dalam kaset CRISPR dan memperoleh rintangan yang diperlukan. Untuk ketegangan industri rintangan sedemikian tidak banyak menyakitkan. Sesuatu seperti suntikan. Atau dengan cara yang sama untuk menyusun kepekaan kekal kepada antibiotik untuk ketegangan percubaan.Ia diketahui bahawa bakteria, sebagai peraturan, dengan cepat mengembangkan ketahanan terhadap antibiotik. Walau bagaimanapun, perkembangan rintangan boleh diperlahankan: untuk ini anda perlu meletakkan penghalang CRISPR untuk plasmid yang membawa unsur-unsur genetik rintangan (Rajah 5).

Rajah. 5 Mekanisme untuk membangunkan rintangan kepada phages atau unsur mudah alih disebabkan oleh spacer buatan yang diperkenalkan. Imej dari Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath, 2017. Satu dekad penemuan: fungsi dan aplikasi CRISPR

Dalam hal ini, adalah penting bahawa sistem perlindungan berfungsi bukan sahaja dalam sel-sel prokariotik, tetapi juga dalam eukariota. Sudah tentu, sel eukariotik tidak dapat menempatkan spacer dengan palindrome dalam genomnya, tetapi versi kerja crRNA-casdi mana RNA adalah pelengkap kepada urutan sasaran dalam genom virus akan sangat membantu. Oleh itu, kesan crRNA- telah diuji dengan kejayaan yang besar.cas terhadap HIV. Para saintis telah bekerja dengan budaya sel yang dijangkiti virus ini. Dengan merawat mereka dengan crRNA-cas, yang membawa spacer dari HIV, mereka menyingkirkan sel-sel jangkitan (lihat W. Hu et al., 2014. Infeksi HIV-1). CRRNA mendapati laman web yang dimasukkan ke dalam genom sel dan dengan bantuan Cas9 meneutralkannya. Dalam kes ini, pengenalpastian dan pemotongan urutan adalah sangat tepat, tidak ada "perlu" serpihan DNA selular yang rosak.Bode ini baik untuk mencari penawar untuk HIV.

Dan jika ketegangan dirawat dengan phage, DNA yang dimasukkan secara buatan ke dalam serpihan CRISPR dengan spacer dari genom strain ini, maka bakteria akan mula memusnahkan diri mereka. Kerana mesin transkripsi bakteria pasti akan membaca crRNA dengan serpihannya sendiri, dan mereka akan mencari pelengkap pada genom bakterinya dan memotongnya dengan nukleus mereka sendiri (Rajah 6). Ini adalah skim perlindungan antimikrobial.

Rajah. 6 Jangkitan dengan phage yang membawa unsur-unsur genom mikroba dalam kaset CRISPR dan pengaktifan sistem ini membawa kepada kemusnahan bakteria. Imej dari R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Satu dekad penemuan: fungsi dan aplikasi CRISPR

Sistem CRISPR boleh disesuaikan untuk menyunting genom atau untuk menghentikan bacaan gen individu. Dalam kes pertama, perlu menambahkan enzim pembaikan kepada CRISPR (lihat pembaikan DNA). Kemudian crRNA di tempat yang betul akan menyertai urutan DNA, endonukleases akan memotongnya, dan pembaikan protein akan menyelesaikan urutan yang betul (Rajah 7). Ini berguna untuk mencari dan menyunting mutasi individu. Dalam hal perencatan transkripsi, crRNA hanya mengambil tempat yang tepat,Polimerase RNA disekat dan bacaan dihentikan. Untuk tujuan sedemikian, mutan Cas9 digunakan, yang mana rantaian DNA tidak masuk.

Rajah. 7 Editing, dan seterusnya mengelakkan transkripsi dalam bakteria: mutasi boleh mengedit dengan memasukkan spacer CRISPR mutan dalam genom faj itu; lagi menganggap crRNK dengan spacer mutan dalam genom bakteria itu dan protein diubahsuai pembaikan; jika gen digunakan dalam pembinaan ini cas9 dengan nykaza mutan (dcas9), maka tempat yang betul akan dijumpai, tetapi selepas sistem itu hanya disekat. Imej dari R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Satu dekad penemuan: fungsi dan aplikasi CRISPR

Untuk bekerja dengan sel-sel eukariot konstruk yang diwujudkan daripada protein crRNK dan Cas-beroperasi dengan DNA eukariot. Ia tidak semestinya perlu menanamkan virus pembawa CRISPR-cas ke dalam sel. Jika ligamen molekul crRNK dengan moiety disasarkan dikehendaki dan Cas masuk ke dalam sel, yang crRNK menyertai nuclease urutan DNA teliti memotong serpihan yang diingini, dan protein sekali lagi akan melengkapkan pembaikan urutan diperbetulkan pelengkap kepada template. kerja itu telah, sebagai contoh, yang diadakan untuk pembetulan penglihatan pada tikus c retinitis pigmentosa (lihat. W.-H. Wu et al., 2016.Pembaikan CRISPR mendedahkan (model retinitis pigmentosa pramatik).

Retinitis pigmentosa adalah penyakit di mana pembentukan rod dalam retina mengalami gangguan. Ia sering dijumpai pada manusia (36 ribu kes direkodkan setiap tahun), tetapi untuk penyelidikan terdapat model retinitis pigmen pada tikus. Ia diketahui bahawa dalam tikus penyakit ini disebabkan oleh satu daripada dua mutasi dalam gen tersebut Pde6b (mutan dengan retinitis mempunyai nama rd1) – sama ada titik mutasi Y347X, atau memasukkan virus Xmv-28, tetapi yang mana kedua-duanya tidak jelas. Tugas itu seolah-olah ini: untuk mengetahui mana dari kedua-dua mutasi tersebut menyebabkan kehilangan penglihatan dan sama ada mungkin, dengan menghapus mutasi, untuk memperbaikinya.

Sebagai permulaan, saintis telah mencipta gabungan molekul crRNA dengan Cas9, manakala dalam urutan RNA suatu rantau dengan mutasi Y347X dijangka. Kemudian, molekul penderma, oligonukleotida, dengan serpihan disasarkan yang normal, bukan mutan, telah dibina. Semua kompleks ini menggunakan plasmid telah dihantar ke telur tikus yang disenyawa dengan mutasi retinitis. Ia diandaikan bahawa crRNA-Cas9 akan memotong bahagian mutan DNA, dan sementara itu, oligonukleotida biasa akan berfungsi sebagai asas untuk melengkapkan potong potong (Rajah 8).

Rajah. 8 Skim eksperimen dengan mutasi Y347X: dalam exon gen mutanPde6b (rd1) akhirnya harus dimasukkan ke dalam sepotong nukleotida TAT dan bukannya TAA; Untuk melakukan ini, sekeping TAA mesti terlebih dahulu dipotong dengan teliti, dan kemudian TAT selesai dengan betul. Imej dari W.-H. Wu et al., 2016. Pembaikan CRISPR mendedahkan satu model preclinical retinitis pigmentosa

Daripada zygote yang dirawat dengan cara ini, tikus-tikus yang normal berkembang, di mana mereka menguji pelbagai parameter fungsi visual. Secara amnya, rawatan itu berfungsi: dalam 7 daripada 11 haiwan, retina kelihatan sihat (Rajah 9), bilangan rod adalah normal, dan tindak balas fisiologi untuk cahaya di retina juga pulih. Benar, seperti yang ditekankan oleh penyelidik, dalam beberapa kes, penunjuk mata kanan dan kiri berbeza. Ini bermakna penyisipan dan pembaikan berlaku dalam corak mozek, dan bukan hanya pada peringkat zigot, tetapi kemudian, apabila pembentukan struktur simetri embrio berlaku.

Rajah. 9 Pandangan fundus saraf optik dalam tikus yang sihat, dalam mutanPde6b (rd1) dan dalam sembuh dengan kompleks crRNA-Cas9; Pembuluh darah normal dan retina normal dalam kes pertama dan terakhir dan struktur degeneratif di kedua dapat dilihat. Imej dari W.-H. Wu et al., 2016. Pembaikan CRISPR mendedahkan satu model preclinical retinitis pigmentosa

Oleh itu, penulis menyimpulkan bahawa, dengan menyunting gen mutan, adalah mungkin, pertama,membuktikan bahawa dalam tikus retinitis pigmentosa disebabkan oleh mutasi mata, bukan penyebaran virus (ia tetap tidak berubah dalam tikus sembuh). Kedua, dan yang paling penting, berjaya membetulkan fungsi visual mutan. Sesungguhnya, pada manusia, penyakit ini disebabkan oleh mutasi dalam gen yang serupa.

Kerja ini juga mempunyai kesinambungan (lihat K. A. Schaefer et al., 2017. Mutasi yang tidak dijangka selepas penyuntingan CRISPR-Cas9 dalam vivo), yang mencerminkan proses saintifik progresif baik secara umum dan dalam satu makmal. Kumpulan yang sama memeriksa sama ada pengeditan CRISPR selamat untuk haiwan dan sama ada ia mempunyai akibat yang tidak diingini. Kajian semacam itu semestinya perlu kerana mana-mana ejen terapi tidak boleh mempunyai kesan sampingan yang serius. Dan jika anda merawat retinitis, maka di tempat lain genom tidak muncul mutasi yang tidak perlu. Pemeriksaan ini mengambil masa setahun. Untuk ini, adalah perlu untuk menjalankan penjujukan DNA genom penuh tikus sembuh, dan kemudian membandingkan pelbagai mutasi yang diperolehi dengan kemungkinan mutasi dalam jenis liar dan dalam tikus yang tidak dirawat daripada garis mutan rd1. Mutasi yang unik yang berlaku hanya dalam tikus sembuh, dan kemungkinan besar adalah lampiran yang tidak diingini.

Terdapat banyak mutasi unik seperti ini, kira-kira satu setengah ribu.Daripada jumlah ini, 1397 berlaku dalam mutasi mata dan 117 dalam penyisipan dan penghapusan, iaitu kira-kira seratus kali lebih tinggi daripada latar belakang mutasi biasa. Adalah dipercayai bahawa apabila crRNA-Cas9 beroperasi, lebih cenderung untuk mengharapkan kemasukan atau penghapusan yang tidak diingini. Tetapi gambar itu hanya sebaliknya, mutasi mata yang paling. Angka-angka ini bermakna bahawa unjuran mutasi sampingan berdasarkan analisis bioinformatik mungkin memandang rendah beberapa faktor penting. Dan sehingga kaedah anggaran ditingkatkan, lebih baik bergantung pada penjujukan genom seluruhnya. Adalah jelas bahawa kaedah ini masih memerlukan penambahbaikan teknikal, walaupun potensi terapeutiknya sangat tinggi.

Sumber:
1) Rodolphe Barrangou, Christophe Fremaux, Hélène Deveau, Melissa Richards, Patrick Boyaval, Sylvain Moineau, Dennis A. Romero, Philippe Horvath. CRISPR menyediakan ketahanan terhadap virus dalam prokariota // Sains. 2007. V. 315. P. 1709-1712. DOI: 10.1126 / sains.1138140.
2) Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath. Satu dekad penemuan: fungsi dan aplikasi CRISPR // Alam Mikrobiologi. 2017. V. 2. Nombor artikel: 17092. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2017.92.
3) Wen-Hsuan Wu, Yi-Ting Tsai, Sally Justus, TingTing Lee, LiJuan Zhang, Chyuan-Sheng Lin, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan, Stephen H. Tsang. Pembaikan CRISPR mendedahkan model retinitis pigmentosa secara pramatikal Terapi molekul. 2016. V. 24. I. 8. P. 1388-1394. DOI: //dx.doi.org/10.1038/mt.2016.10.
4) Kellie A. Schaefer, Wen-Hsuan Wu, Diana F. Colgan, Stephen H. Tsang, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan. Mutasi yang tidak dijangka selepas pengeditan CRISPR-Cas9 di vivo // Kaedah Alam. 2017. V. 14. P. 547-548. DOI: 10.1038 / nmeth.4293.

Elena Naimark


Like this post? Please share to your friends:
Tinggalkan Balasan

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: