Hadiah Nobel dalam Kimia - 2017 • Arkady Kuramshin • Berita Sains mengenai "Unsur" • Hadiah Nobel, Mikrobiologi, Biologi Molekul, Teknologi

Hadiah Nobel dalam Kimia – 2017

Rajah. 1. Pemenang Hadiah Nobel dalam Kimia 2017. Dari kiri ke kanan: Jacques Dubose, Joachim Frank dan Richard Henderson. Gambar dari sciencenews.org

Minggu lalu, ia diumumkan bahawa Hadiah Nobel Switzerland 2017 dalam Kimia akan diterima oleh Swiss Jacques Dubose, Jerman-Amerika Joachim Frank dan Scot Richard Henderson untuk "membangunkan kaedah mikroskopi cryoelectron resolusi tinggi untuk menentukan struktur tiga dimensi biomolekul dalam larutan. Kerja-kerja mereka dibenarkan, bermula dari tahun 80-an abad yang lalu, untuk menguji dan secara beransur-ansur meningkatkan jenis mikroskopi ini sehingga pada tahun-tahun kebelakangan ini para saintis dapat mengkaji molekul biologi kompleks dalam butiran terkecil. Jawatankuasa Nobel menyatakan bahawa kaedah mikroskopi cryoelectron menerjemahkan biokimia ke dalam era baru, yang membolehkan ia mengisi banyak jurang dalam pengetahuan mengenai molekul dan sistem hidup.

Jawatankuasa Nobel menganggap bahawa sumbangan terbesar dalam pembangunan mikroskopi cryoelectron – satu kaedah yang membolehkan secara visual mengkaji struktur rumit protein, asid nukleik dan molekul lain, serta mengkaji proses-proses di mana mereka mengambil bahagian, yang dibuat oleh Jacques Dubochet, orang asal Amerika asal Jerman Joachim Frank dan Scot Richard Henderson.

Dengan serta-merta, kita perhatikan bahawa tidak mungkin untuk memanggil mikroskop elektron kriogenik yang asasnya baru dan mencukupi kaedah penyelidikan fizikal bahan. Sebaliknya, ia adalah satu jenis mikroskop elektron penghantaran (salah satu pengarang kaedah ini, Ernst Ruska, menerima Hadiah Nobel pada tahun 1986), yang khusus disesuaikan untuk mengkaji objek mikrobiologi.

Rajah. 2 Mikroskop cryoelectron dipasang di Northwestern University, Amerika Syarikat. Foto dari vox.com

Dalam mikroskop elektron penghantaran, sampel yang telus kepada elektron (biasanya tenth dan seratus mikron) melewati sampel elektron melalui elektron yang cukup nipis yang, melalui sampel, diserap dan bertaburan, mengubah arah gerakan. Perubahan ini boleh didaftarkan (kini matriks CCD, pencipta di mana, Willard Boyle dan George Smith, memenangi Hadiah Nobel dalam Fizik pada tahun 2009) digunakan paling kerap dan, selepas analisis, mendapatkan imej objek yang sedang diteliti dalam satah serenjang dengan rasuk. Sejak panjang gelombang elektron intrinsik (puluhan picometer pada tenagaciri-ciri mikroskop elektron) jauh lebih kecil daripada panjang cahaya cahaya di rantau yang kelihatan (beratus-ratus nanometer), menggunakan mikroskop elektron anda boleh melihat lebih banyak butiran lebih baik daripada mikroskop optik, termasuk mikroskop pendarfluor resolusi tinggi (FVRM), dibangunkan Pemenang Hadiah Nobel dalam bidang kimia, Eric Betzig, Stefan Khellem dan William Merner.

Resolusi menghadkan mikroskop elektron – beberapa angstroms (tenths dari nanometer) – hampir mencapai. Ini memungkinkan untuk mendapatkan imej di mana, contohnya, atom individu boleh dibezakan. Sebagai perbandingan: batas kemungkinan fMBP ialah 10-20 nm. Tetapi hanya untuk membandingkan kaedah yang berbeza untuk resolusi akhir adalah agak tidak berguna. Mikroskop elektron mempunyai resolusi yang tinggi, tetapi mereka tidak boleh selalu digunakan. Hakikatnya, sampel itu, sebagai tambahan kepada pengisaran semasa penyediaan, mengalami penyinaran yang agak serius dengan rasuk elektron semasa kajian itu sendiri (kira-kira bercakap, rasuk yang lebih sengit, kesilapan yang lebih sedikit dan lebih baik hasilnya) semasa dalam vakum (vakum diperlukan untuk medium tidak menyebarkan elektron di luar sampel, dengan itu memperkenalkan penyelewengan yang tidak perlu).Keadaan sedemikian adalah tidak sesuai jika anda perlu mengkaji molekul dan objek biologi yang rumit – mereka rosak dalam persekitaran yang jarang dan ada banyak ikatan yang agak lemah di dalamnya yang hanya akan runtuh semasa kajian.

Pemahaman bahawa, tanpa penambahbaikan tambahan, mikroskop elektron tidak dapat disesuaikan dengan kajian biomolekul dan sistem hidup, muncul sejurus selepas penciptaannya. Contohnya, misalnya, menulis tiga tahun kemudian selepas demonstrasi prinsip operasi mikroskop elektron oleh Ernst Ruska pada tahun 1931, ahli fizik Hungaria Ladislav Marton (L. Marton, 1934. Mikroskopi Elektron Objek Biologi). Dalam artikel yang sama, Marton mencadangkan cara untuk menyelesaikan masalah ini. Khususnya, beliau juga menegaskan bahawa sampel pembekuan boleh mengurangkan kerosakan daripada penyinaran sinaran elektron. Adalah penting untuk diperhatikan bahawa, walaupun ini tidak ditunjukkan dalam artikel oleh Marton, pembekuan sampel juga membantu dengan mengurangkan getaran haba molekul, yang juga menyumbang kepada peningkatan imej yang dihasilkan.

Pada tahun 1970-an dan 1980-an, sains dan teknologi mencapai tahap pembangunan yang mencukupi untuk mengatasi segala kesulitan. Dan ini sebahagian besarnya disebabkan usaha para penerima hadiah tahun ini.

Richard Henderson adalah yang pertama untuk mendapatkan imej protein asimetri dengan resolusi atom menggunakan mikroskopi elektron penghantaran (dengan penyejukan sampel). Beliau memulakan penyelidikannya pada pertengahan tahun tujuh puluhan. Dan pada mulanya, Henderson berusaha untuk mendapatkan struktur beberapa protein dari membran sel dengan menggunakan kaedah analisis sinar-X, yang kemudian dapat memberikan penyelesaian beberapa angstroms. Walau bagaimanapun, dengan cepat menjadi jelas bahawa kaedah ini tidak mencapai hasil yang baik: bahan yang sedang dikaji mestilah dalam bentuk kristal, dan protein membran yang diekstrak daripada persekitaran mereka sama ada mengikis dengan buruk atau kehilangan bentuknya sama sekali. Kemudian dia beralih ke mikroskop elektron.

Satu protein tertentu telah dipilih – bacteriorhodopsin – dan ia telah memutuskan untuk tidak mengeluarkannya dari membran, tetapi untuk memeriksa secara langsung di dalamnya. Para saintis juga melengkapkan sampel dengan penyelesaian glukosa untuk melindungi dari pengeringan dalam vakum. Ini membantu menyelesaikan masalah memelihara struktur. Kemudian Henderson dan rakan-rakannya menghadapi masalah yang telah diterangkan tentang pemusnahan sampel di bawah tindakan rasuk elektron.Ia telah membantu menyelesaikan beberapa faktor.

Pertama, bacteriorhodopsin terletak di dalam membran secara teratur, jadi pertimbangan yang teliti terhadap keteraturan ini dalam kombinasi dengan penangkapan dari sudut yang berbeza banyak membantu apabila merancang gambar. Ini membantu mengurangkan intensiti rasuk dan mengurangkan masa pendedahan, tetapi untuk memenangi kualiti. Sudah pada tahun 1975, adalah mungkin untuk mendapatkan imej protein ini dengan resolusi 7 angstroms (Rajah 3, lihat R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Model tiga dimensi membran ungu oleh mikroskop elektron).

Rajah. 3 Di sebelah kiri: salah satu "snapshots" utama membran bakteria Halobium halobiumdiperolehi oleh kumpulan Henderson. Garis hitamseperti rambut kusam adalah kesan molekul bacteriorhodopsin. Ia dilihat bahawa mereka kebanyakannya berorientasikan serenjang ke satah imej. Garis putus-putus melintasi batas anggaran satu molekul protein ini. Hak: hasil pemodelan tiga dimensi struktur biorhodopsin molekul dengan resolusi 7 angstroms. Imej dari artikel R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Model tiga dimensi membran yang diperolehi oleh mikroskop elektron

Kedua, Henderson mempunyai peluang untuk melakukan perjalanan ke pusat-pusat saintifik yang berbeza dan mencuba mikroskop elektron yang berbeza. Oleh kerana tidak terdapat penyatuan pada tahun-tahun tersebut, mikroskop berbeza mempunyai kelebihan dan kelemahan mereka: pengasingan ruang darjah yang berbeza,tahap penyejukan sampel yang berbeza (ini mengurangkan kerosakan daripada penyinaran elektron), tenaga berlainan rasuk elektron, kepekaan yang berbeza dari pengesan. Oleh itu, kemungkinan mengkaji objek yang sama pada mikroskop yang berlainan membolehkan pertama untuk memilih keadaan "paling tidak menguntungkan" untuk mendapatkan imej, dan kemudian secara beransur-ansur memperbaikinya. Oleh itu Henderson mengumpulkan data dan memperoleh lebih banyak struktur yang lebih tepat bakterododin. Pada tahun 1990, beliau menerbitkan artikel di mana model protein ini dibentangkan dengan resolusi atom (R. Henderson et al., 1990).

Rajah. 4 Model bacteriorhodopsin yang diperoleh menggunakan mikroskopi elektron penghantaran – menggunakan sebatian ini sebagai contoh, Richard Henderson menunjukkan kemungkinan menggunakan kaedah untuk mendapatkan imej objek biologi dengan resolusi atom. Garis tebal warna yang berbeza – ikatan kimia antara atom bacteriorhodopsin, permukaan jejari putih menunjukkan sempadan ketumpatan elektron di sekeliling atom dan kumpulan atom. Gambar dari R. Henderson et al., 1990. Model untuk struktur bakterododonin berdasarkan mikroskopi cryo-elektron resolusi tinggi

Dalam kajian perintis ini, Henderson menunjukkan bahawa mikroskopi cryoelectron dapat menghasilkan imej dengan resolusi,yang tidak lebih buruk daripada kaedah analisis sinar-X – pada masa itu merupakan satu kejayaan. Walau bagaimanapun, hasil ini pada dasarnya menggunakan fakta bahawa bakterodododin secara kerap terletak di dalam membran sel, dan tidak jelas sama ada ia mungkin untuk mencapai resolusi sedemikian untuk molekul "tidak teratur" yang lain.

Masalah pemprosesan isyarat lemah dari molekul aktif biologi yang secara rawak ditemui diselesaikan oleh pemenang Hadiah Nobel 2017, Joachim Frank. Sumbangan utamanya untuk mikroskopi cryoelectron adalah penciptaan algoritma untuk menganalisis imej dua dimensi yang diperolehi menggunakan mikroskopi cryoelectron, yang membolehkan kita membina model tiga dimensi berkualiti tinggi. Algoritma serupa telah dibangunkan untuk kaedah mikroskopi yang lain. Frank telah dioptimumkan dan dalam banyak cara menyempurnakan kaedah analisis matematik, yang membolehkan untuk memisahkan maklumat berguna yang diperolehi semasa mikroskopi elektron daripada isyarat yang disebabkan oleh bunyi bising. Bunyi timbul dalam alat elektronik yang tepat untuk pelbagai sebab: turun naik secara rawak dalam arus dan voltan boleh disebabkan oleh pelepasan elektron yang tidak sekata dalam blok electrovacuum,penyelewengan dalam pembentukan dan penggabungan semula pembawa caj (elektron dan lubang konduksi) dalam blok semikonduktor, pergerakan haba pembawa semasa dalam konduktor (bunyi terma), atau gangguan luaran (walaupun pada hakikatnya segala-galanya biasanya terlindung dengan baik).

Rajah. 5 Kaedah pengiraan isyarat dalam mikroskopi cryoelectron, yang dicadangkan oleh J. Frank. Skim dari nobelprize.org tapak

Tugas juga rumit oleh ini. Sekiranya benda-benda, walaupun mereka adalah sama atau lebih kurang sama, kerana mereka seharusnya berada dalam kajian sedemikian, tidak bercelaru, mereka memberikan isyarat yang sedikit berbeza dalam struktur yang boleh mengaburkan satu sama lain. Lebih-lebih lagi, punca kesilapan bunyi atau algoritma yang tidak jelas – tidak mudah ditentukan. Secara skematik, prinsip pemprosesan data ditunjukkan dalam Rajah. 5: banyak imej datar molekul yang dipelajari dibersihkan dengan bunyi dan diketik mengikut "sudut", maka profil yang lebih berkualiti dibina daripada imej dengan sudut rapat, dan, akhirnya, model tiga dimensi dibina dari profil ini.

Pada tahun 1981, Frank meringkaskan model matematik dalam versi pertama program komputer SPIDER (Sistem Data Pemrosesan Data dari Mikroskopi Elektron dan Kawasan Berkaitan, penerbitan pertama: J.Frank et al., 1981. Spider – Sistem perisian modular untuk pemprosesan imej elektron). Pakej perisian ini wujud dan sedang dikemas kini setakat ini, lebih-lebih lagi, program ini bebas untuk diedarkan, yang sememangnya memudahkan kerja saintis di seluruh dunia. Frank menggunakan algoritma sendiri untuk mendapatkan imej permukaan ribosom – yang terdiri daripada helai RNA dan protein organoid sel yang berkaitan, yang digunakan untuk biosintesis protein daripada asid amino berdasarkan maklumat genetik.

Rajah. 6 Kaedah penyediaan sampel untuk mikroskopi cryoelectron, yang dicadangkan oleh J. Dubcecher. Skim dari nobelprize.org tapak

Awalan "cryo" muncul dalam mikroskop elektron berkat pemenang ketiga, Jacques Duboche. Beliau membangunkan satu kaedah untuk penyejukan cepat larutan akueus dengan sampel (J. Dubochet, A. W. McDowall, 1981. Vitrifikasi air untuk mikroskop elektron). Selain itu, air harus membekukan dengan cepat sehingga molekul tidak mempunyai masa untuk bersatu dalam kisi kristal, membeku kerana ia (lihat ais amorfus). Ini dicapai dengan cepat merendam filem tipis penyelesaian dengan sampel dalam bekas dengan etana cair disejukkan ke -160 ° C (Rajah 6). Kaedah pembekuan yang betul boleh dipanggil kunci kepada kejayaan keseluruhan kaedah, memandangkan memerintahkan kristal ais boleh menyebabkan pembelahan elektron, memesongkan maklumat tentang molekul di bawah kajian.Oleh kerana berat molekul protein dan asid nukleat yang tinggi, molekul-molekul ini adalah kekok, supaya dengan membekukan segera mereka tidak mempunyai masa sama ada untuk mengubah kedudukan atau mengubah bentuk. Iaitu, struktur molekul aktif secara biologi semasa pembekuan cepat dengan kaedah ini tidak berubah. Menggunakannya, Dubboche buat kali pertama menggunakan mikroskopi cryoelectron untuk mengkaji struktur virus (Rajah 7, lihat M. Adrian et al., 1984. Mikroskopi elektron cryo-elektron).

Rajah. 7 Di sebelah kiri: imej bakteria T4, diperolehi oleh kumpulan J. DuBoche. Anda boleh membezakan beberapa zarah virus sepenuhnya. Hak: model tiga dimensi virus ini. Imej dari artikel M. Adrian et al., 1984. Mikroskopi elektron mikroskopi dan dari saintifik.pictures

Semasa tahun 1990-an dan 2000-an, mikroskopi cryoelectron secara beransur-ansur berkembang dan bertambah baik dengan perkembangan kekuatan pengkomputeran dan ketepatan instrumentasi. Tetapi pembungaan sebenar mikroskopi cryoelectron bermula pada tahun 2012. Ia dikaitkan dengan penampilan pengesan elektronik berasaskan CMOS langsung, yang boleh mengesan secara langsung elektron yang telah melalui sampel. Ini membolehkan kami menyederhanakan reka bentuk mikroskop elektron, membuang sistem yang kompleks untuk memfokuskan dan penukaran isyarat dan mengurangkan bilangan nod yang boleh membuat bunyi rawak.Akibatnya, penyelesaian kaedah mikroskopi cryoelectron meningkat kepada 2-3 angstrom (Rajah 8).

Rajah. 8 Kemajuan dalam meningkatkan resolusi mikroskopi cryoelectron sejak beberapa tahun kebelakangan pada contoh beta-galactosidase enzim. Gambar dari vox.com

Oleh itu, pada tahun 2017, hampir enam dekad selepas penentuan kristal struktur struktur hemoglobin oleh Max Perutz (Max Perutz dan John Kendru menerima Hadiah Nobel dalam Kimia 1962 untuk mengkaji struktur protein globular), mikroskopi cryoelectron membolehkan kajian satu molekul protein ini dalam kristal, dan dalam larutan (Rajah 9).

Rajah. 9 Di atas: Radiograf kristal hemoglobin, imej dari artikel oleh J. D. Bernal, I. Fankuchen & Max Perutz, 1938. Kajian X-Ray untuk Chymotrypsin dan HÆmoglobindi sebelah kiri) dan dibina semula pada struktur 3D roentgenogram molekul hemoglobin (di sebelah kanan). Bawah: unjuran berbeza molekul hemoglobin yang diperolehi oleh mikroskop cryoelectron (di sebelah kiri) dan model tiga dimensi molekul ini (di sebelah kanan), imej dari M. Khoshouei et al., 2017. Struktur hemoglobin cryo-EM pada 3.2E ditentukan dengan plat fasa Volta. Kanan atas: model molekul hemoglobin dari rcsb.org

Maklumat tepat mengenai struktur sebatian aktif biologiKeistimewaan interaksi mereka antara satu sama lain dan penyertaan mereka dalam proses biokimia adalah penting dalam istilah asas dan dalam menyelesaikan masalah praktikal, misalnya, dalam pembangunan ubat baru dan penciptaan kaedah baru untuk rawatan penyakit.

Satu contoh aplikasi praktikal mikroskopi cryoelectron di kawasan ini boleh dianggap sebagai kajian terhadap virus Zika (Rajah 10). Semasa wabak wabak Zika di Brazil pada tahun 2016, para penyelidik menghabiskan beberapa bulan mendapatkan maklumat mengenai struktur virus menggunakan mikroskopi cryoelectron (D. Sirohi et al., 2016. Resolusi 3.8 Å penyelesaian cryo-EM virus Zika).

Rajah. 10 Struktur virus Zika, ditentukan menggunakan mikroskopi cryoelectron. Gambar dari virology.ws

Satu lagi contoh ialah mikroskopi cryoelectron tahun ini memungkinkan untuk mendapatkan struktur kapsid daripada wakil terbesar keluarga virus herpes – sitomegalovirus manusia (X. Yu et al., 2017.). Hasil kajian ini menjadi asas untuk mencari kemungkinan sekumpulan kapsid virus yang boleh menjadi sasaran molekul untuk ubat antivirus.

Arkady Kuramshin


Like this post? Please share to your friends:
Tinggalkan Balasan

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: