CRISPR / Cas terhadap penyakit Huntington

CRISPR / Cas terhadap penyakit Huntington

Tuyana Malankhanova, Suren Zakian
"Sains Pertama" №4 (75), 2017

Di atas: "sihat" gen NTT pengekodan huntingtin protein. Bawah: HTT gen mutan

Hari ini, menurut Pusat Penyelidikan Harvard Neuro, di Amerika Syarikat sahaja, kira-kira 5 juta orang menderita penyakit Alzheimer; 1 juta – dari penyakit Parkinson; 400 ribu – dari pelbagai sklerosis; 30 ribu setiap – dari sclerosis lateral amyotrophic (penyakit Lou Gehrig) dan penyakit Huntington. Gangguan ini, yang tergolong dalam kumpulan penyakit neurodegenerative, tidak difahami dengan baik, dan tidak ada rawatan berkesan bagi mereka. Alat pengeditan gen, sistem CRISPR / Cas9, yang sedang aktif dan berjaya digunakan dalam biologi dan perubatan, dapat membantu menyelesaikan masalah ini.

Mengenai pengarang

Tuyana Bairovna Malankhanova – Pelajar pascasiswazah, Universiti Negeri Novosibirsk, Pembantu Makmal Kanan, Makmal Perkembangan Epigenetik, Institut Cytology dan Genetika, Cawangan Siberia dari Akademi Sains Rusia (Novosibirsk). Penulis dan pengarang bersama 3 kertas saintifik dan 1 monograf.

Suren Minasovich Zakian – Doktor Sains Biologi, Profesor, Ketua Makmal untuk Pembangunan Epigenetics Institut Cytology dan Genetika,makmal sel stem Pusat Teknologi Perubatan Baru Institut Biologi Kimia dan Perubatan Asas Cawangan Siberia dari Akademi Sains Rusia (Novosibirsk); Makmal Perubatan Molekul dan Selular, Pusat Penyelidikan Perubatan Nasional. Acad. E.N. Meshalkina (Novosibirsk), Makmal Kejuruteraan Seluler FEN dari Universitas Negeri Novosibirsk. Pengarang dan pengarang bersama lebih daripada 200 karya sains, termasuk 33 monograf, dan 5 paten.

Sepanjang dekad yang lalu, jangka hayat purata seseorang telah bertambah, dan kini semakin ramai orang yang hidup hingga usia ketika pelbagai penyakit yang berkaitan dengan usia tua dapat mula menunjukkan diri mereka sendiri. "Penyakit-penyakit tua" seperti penyakit neurodegenerative, yang kebanyakannya dicirikan oleh kematian sel-sel saraf tertentu yang secara beransur-ansur dan selektif. Punca-punca penyakit ini paling sering berlaku dalam genom.

Pertimbangkan masalah ini dengan contoh. Penyakit Huntington (nama lain adalah sindrom Huntington, chorea Huntington, atau sindrom Huntington), yang ditunjukkan oleh gejala seperti kehilangan kawalan kawalan motor dan gangguan mental.Walaupun mutasi genetik menyebabkan penyakit ini dikenal pasti lebih daripada 20 tahun yang lalu, mekanisme molekul pembangunannya masih belum difahami sepenuhnya, sama ada rawatan yang berkesan telah didapati untuk penyakit ini.

Orang yang mempunyai penyakit Huntington mempunyai pergerakan yang tidak normal dan tidak terkawal oleh hampir semua otot badan ("tarian St Vitus"), serta gangguan mental dan kognitif. Penyakit serius ini biasanya bermula selepas 35 tahun dan mempunyai sifat progresif.

Pemodelan penyakit

Penyebab penyakit Huntington adalah peningkatan dalam bilangan trinucleotide CAG yang diulangi dalam gen HTT yang menodai protein huntingting. Biasanya, gen ini mengandungi 8 hingga 36 ulangan, tetapi apabila angka ini mencapai 37 atau lebih, penyakit itu mula berkembang. Triple CAG mengkodekan asid amino glutamin. Oleh itu, dalam penyakit Huntington, huntingtin disintesis dengan rantaian poliolutamina yang dilanjutkan. Protein seperti itu mempunyai struktur spatial yang tidak teratur dan tidak dapat melaksanakan fungsinya dalam sel, yang, dengan cara itu, masih tidak diketahui. Di samping itu, di striatumSalah satu bahagian otak yang mengawal nada otot, satu bentuk protein mutant membentuk agregat yang mempunyai kesan toksik. Dalam kes ini, keterukan dalam perjalanan penyakit itu bergantung kepada jumlah ulang CAG.

Untuk meneroka proses molekul yang membawa kepada perkembangan patologi, serta untuk menguji ubat-ubatan baru, kita memerlukan model biologi yang mereproduksi penyakit manusia secepat mungkin. Untuk mencipta satu model penyakit Huntington, saintis memperkenalkan gen manusia NTT mutan ke dalam genom tikus makmal. Walau bagaimanapun, hasil yang diperolehi dalam model "tetikus" tersebut tidak selalu mencerminkan proses yang berlaku dalam tubuh manusia secara tepat. Keluar – garisan sel berasal dari manusia.

Untuk mempelajari penyakit Huntington, adalah perlu untuk mempunyai sel striatum, tetapi sukar untuk mendapatkan bahan biomanya. Masalah ini diselesaikan oleh sel stem pluripoten yang disebabkan (IPSC), yang agak mudah diprogramkan semula, boleh diperolehi daripada sel-sel kulit manusia atau darah. Selanjutnya, sel-sel ini boleh diperluas dalam kuantiti tanpa had dan untuk membezakan (mengubah) ke hampir mana-mana jenis sel yang dikehendaki.

Sistem pengeditan genomik CRISPR / Cas9 kini digunakan untuk membuat garis-garis sel yang membangkitkan penyakit Huntington melalui pengeluaran sel induk pluripotent (iPSCs) dari sel-sel somatik manusia.

Biasanya, apabila memodelkan penyakit, sel-sel dari orang sakit digunakan, dan sebagai kawalan, dari penderma yang sihat. Walau bagaimanapun, disebabkan kehadiran dalam genom manusia sejumlah besar nukleotida tunggal polimorfisme pasangan sel tersebut tidak betul-betul betul untuk membandingkan. Kawalan yang sesuai untuk sel-sel "berpenyakit" akan menjadi sel dengan genom yang sama, tetapi tanpa mutasi menyebabkan penyakit ini. Sel-sel sedemikian dipanggil pasangan isogenik atau mengikut baris. Untuk mewujudkan garis isogenik dan gunakan alat untuk menyunting gen CRISPR / Cas9.

Meneroka persekitaran gen

Walaupun penyakit Huntington adalah penyakit monogenikiaitu, akibat mutasi dalam satu gen, lebih dari 100 gen pemodulasi yang disebut diketahui yang boleh menjejaskan masa gejala pertama, keparahan penyakit, dll. CRISPR / Cas9 berdasarkan GeCKO (Shalem et al., 2014).Ia membolehkan anda membuat keseluruhan perpustakaan sasaran gen untuk CRISPR / Cas9 dan mematikan beribu-ribu gen hanya dalam beberapa langkah. Oleh itu, adalah mungkin untuk menghasilkan dalam masa yang singkat. kalah mati (mati) semua gen pengubahsuaian dan mengetahui bagaimana ini menjejaskan daya maju sel, kelajuan bahagian mereka, dan sebagainya.

Dengan bantuan alatan berdasarkan CRISPR / Cas9, kini anda boleh mengedit bukan sahaja genom, iaitu, maklumat keturunan, tetapi juga epigenomeyang mencerminkan perubahan dalam kerja gen yang tidak mempengaruhi struktur DNA. Terima kasih kepada pengeditan genom, kami mempunyai peluang untuk mengubah tahap ungkapan gen sasaran. Untuk melakukan ini, alat telah dibangunkan, di mana Cas9 dimatikan, pelbagai enzim dilampirkan padanya yang boleh mengaktifkan atau, sebaliknya, menindas tahap pengeluaran satu atau lain protein. Sebagai contoh, dalam kes penyakit Huntington, adalah mungkin untuk menekan secara spesifik sintesis protein mutan, dengan itu mencegah pembentukan agregat protein dan kematian neuron striatum.

Walau bagaimanapun, anda boleh mengaktifkan dan menyusun yang akan menyumbang kepada penyingkiran dipercepat atau penurunan protein dengan struktur yang salah.Sebagai contoh, kesan ini dicapai kerana pengaktifan protein kejutan panas (penjaga) yang melampirkan tanda kematian kepada protein yang tidak normal. Protein yang dilabelkan dengan cara ini memasuki struktur sel khas, di mana ia musnah.

Di samping itu, alat pengubahsuaian epigenome CRISPR / Cas9 boleh mengubah tahap sintesis protein dengan mengubah suai chromatin – kompleks kompak DNA, RNA dan protein dalam kromosom. Anda boleh membuat pengubahsuaian seperti chromatin, yang akan membawa kepada lipatan DNA yang lebih longgar, yang mengaktifkannya transkripsi (membaca maklumat genetik pada RNA). Pengubahsuaian lain, sebaliknya, boleh menyumbang kepada lipatan DNA yang lebih padat dan perlahan atau bahkan menyekat transkripsi sepenuhnya.

Kami memperlakukannya?

CRISPR / Cas9 juga boleh digunakan untuk merawat penyakit Huntington. Terdapat dua pilihan untuk pendedahan: memendekkan CAG berulang atau secara khusus mematikan salinan mutan gen.

Dalam kes pertama, menggunakan rehat CRISPR / Cas9 double-strand dimasukkan dalam urutan dengan pengulangan. Walau bagaimanapun, campur tangan ini mempunyai kesan yang bertentangan – peningkatan jumlah ulang CAG. Masalahnya telah diselesaikan dengan menggunakan nikaz Cas9 – protein mutan Cas9, yang membuat pecahan tunggal dalam DNA. Eksperimen ini menunjukkan bahawa pecahan tunggal berturut-turut di kawasan dengan pengulangan yang terburuk tidak mengubah panjang bahagian dengan pengulangan, dan mengetuai yang terbaik untuk pemendekan yang diharapkan (Cinesi et al., 2016).

Skim ini untuk memendekkan saluran panjang yang berulang dari gen CAG HTT menggunakan sistem CRISPR / Cas9 standard, yang memperkenalkan DNA double-stranded ke DNA, dan menggunakan Cas9 nikac, yang memperkenalkan jurang tunggal terkandas. Oleh: (Cinesi et al., 2016)

Anda boleh menggunakan strategi untuk mematikan gen dalam kes-kes yang jarang berlaku apabila terdapat perbezaan nukleotida tunggal antara dua salinan gen NTT. Jika polimorfisme sedemikian terletak di kedua-dua belah tapak dengan ulangan yang tidak teratur, ia boleh digunakan sebagai sasaran untuk gunting CRISPR / Cas9. Pada masa yang sama, salinan normal gen tidak akan terjejas (Shin et al., 2016).

Penyelidikan mengenai penyakit Huntington menggunakan sistem CRISPR / Cas9 sedang dijalankan hari ini di Rusia. Oleh itu, dalam makmal perkembangan epigenetik Institut Cytology dan Genetika Cawangan Siberia dari Akademi Sains Rusia (Novosibirsk), kerja sedang dilakukan untuk mendapatkan garis-batang sel induk isogenik yang memodelkan penyakit Huntington dengan memperkenalkan jalur CAG yang panjang ke dalam gen NTT biasa, serta membezakan iPSC ke neuron striatum.Pada masa akan datang, penyelidik Novosibirsk merancang untuk meneruskan peranan gen gen pengubah dalam patogenesis penyakit ini menggunakan model sel.

Ada sebab untuk berharap hasil penyelidikan akan membawa kepada penciptaan kaedah rawatan yang berkesan. Di samping itu, mereka boleh membantu dalam kajian penyakit neurodegenerative yang lain, perkembangan yang disebabkan oleh mutasi yang sama.

Sastera
1. Medvedev S.P. Cara menyunting keturunan // Sains secara langsung. 2014. T. 55. No. 1. P. 10-14.
2. Cinesi C., Aeschbach L., Yang B., Dion V. Kontrak CAG / CTG mengulangi menggunakan nickname CRISPR-Cas9 // Nat. Komun. 2016. V. 7. P. 13272-13281.
3. Shalem O., Sanjana N. E., Hartenian E. et al. Pemeriksaan knockout CRISPR-Cas9 berskala genom dalam sel-sel manusia // Sains. 2014. V. 343. N. 6166. P. 84-87.
4. Shin J. W., Kim K.-H., Chao M. J., et al. Pengaktifan secara berterusan mutasi CRISPR / Cas9 khusus alel oleh penyakit Huntington // Hum Mol. Genet. 2016. V. 25. N. 20. P. 4566-4576.


Like this post? Please share to your friends:
Tinggalkan Balasan

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: